Desenvolvimento de um kit baseado em amplificação isotérmica de DNA mediada por loop (LAMP-PCR) em único tubo para o diagnóstico da tuberculose pulmonar

Abstract

A Tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), que afeta principalmente os pulmões, porém, pode acometer outros órgãos. A detecção precoce de um indivíduo com TB é fundamental e, diante desse cenário, ensaios moleculares baseados em PCR estão entre os mais promissores métodosde diagnósticos quando comparados aos utilizados na rotina (baciloscipia e cultura).A amplificação isotérmica de DNA mediada por Loop (LAMP) vem ganhando espaço nos estudos envolvendo diagnóstico de doenças infecciosas por possuir diversas vantagens. Consiste, basicamente, na amplificação e detecção isotérmica de fragmentos contendo o DNA alvo utilizando seis oligonucleotídeos diferentes, especialmente desenhados para amplificar oito regiões nogene de interesse. O presente estudo pretende desenvolver um protótipo de kit baseado na amplificação isotérmica de DNA mediada por Loop (LAMP) em único tubo eficiente na identificação da TB pulmonar, sendo produzido no Brasil. Para a avaliação do limite de detecção do kit, foi feita uma curva de diluição, inicialmente em água MilliQe, em seguida, em escarro. Ambas as curvas foram de fator 10, variando de 100pg/µL à 100ag/µL de DNA do Mtbda cepa de referência H37Rv. Os reagentes do LAMP passaram por um controle de qualidade com a finalidade de avaliar sua durabilidade e estabilidade, durante 3 meses, em uma temperatura semelhante a de geladeira (4ºC). O kit foi testado em amostra biológica de escarro de pacientes diagnosticados com tuberculose (Grupo TB) e pacientes portadores de qualquer outra doença (Grupo não TB) para avaliação de sensibilidade e especificidade. O limite de detecção em água MilliQ e emamostra de escarro sabidamente negativa foi de 1fg/uL e o kit se manteve estável durante os 3 meses na temperatura de 4ºC. Com relação ao desempenho do kit, foram obtidos valores de sensibilidade e especificidade, 98,28% e 95,56%, respectivamente. Devido a sua elevada sensibilidade juntamente ao bom limite de detecção obtido, o desenvolvimentode um protótipo de kit, com grande valor de diagnóstico, permitirá trazer a possibilidade de uma identificação do bacilo mais rápida e eficaz que contribuiráem uma maiordescoberta e casos e no auxílio aos métodos tradicionais para confirmação da doença.