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Title: Adaptação de métodos imunoenzimáticos de diagnóstico da hepatite C para uso com amostras de sangue coletado em papel de filtro
Advisor: Villar, Livia Melo
Ferreira, José Antônio Sá
Members of the board: Almeida, Adilson José de
Silva e Sá, Glória Regina da
Paula, Vanessa Salete de
Authors: Brandão, Camille Petruccio Urago
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: O presente estudo visa à adaptação de ensaios imunoenzimáticos comerciais de diagnóstico da hepatite C para uso em amostras de sangue coletado em papel de filtro (SCPF). Foram coletadas amostras pareadas de soro e SCPF de 411 indivíduos com média de idade de 40 anos, provenientes de banco de sangue e três unidades de saúde. As amostras foram submetidas a dois ensaios imunoenzimáticos (EIEs) para detecção de anticorpos anti-HCV: HCV Ab, Radim (Itália) e ETI-AB-HCVK-4, DiaSorin (Itália); e a dois EIEs para detecção simultânea de antígeno core do HCV e anticorpos anti-HCV, Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA, Bio-Rad (França) e Murex HCV Ag/Ab Combination, Abbott (África do Sul). A detecção de anti-HCV e simultânea de antígeno e anticorpos anti-HCV em amostras de soro foi feita conforme recomendações dos fabricantes, e em SCPF foram avaliados os parâmetros, tampão de eluição, volumes de amostra, de diluente de amostra e de conjugado, tempo de incubação da amostra e valor do ponto de corte (PC). Após otimização desses parâmetros foram determinados os valores de sensibilidade (S), especificidade (E), concordância (valor de kappa), limite de detecção do teste, valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN), precisão intraensaio e interensaio. A estabilidade das amostras de SCPF foi avaliada em diferentes condições ambientais (22-26ºC, 2-8°C e -20°C). Como resultado, o tampão PBS/BSA 0,5% foi selecionado para eluição das amostras de SCPF e estabelecido um aumento no volume de amostra para todos os fabricantes. Os tempos de incubação e os volumes de conjugado seguiram a recomendação dos fabricantes. Para o EIE HCV Ab os valores determinados foram S = 97,50%, E = 99,46%, kappa (k)= 0,959, VPP = 64,59% e VPN = 99,97%, para uma prevalência de doença de 1% na população. Para o EIE ETI-AB-HCVK-4, o PC foi estabelecido pela curva ROCe observou-se S = 88,89%, E = 98,89%, k= 0,875, VPP = 44,71% e VPN = 99,89%. O PC do EIE Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA foi obtido pela curva ROCe verificou-se S = 95,12%, E =100%, k= 0,959, VPP = 100% e VPN = 99,95%. O PC para o EIE Murex HCV Ag/Ab Combinationfoi determinado pela média dos valores de densidade ótica (D.O.) das amostras de SCPF correspondentes àquelas de soro negativas no teste, acrescido de três desvios padrão proporcionando S = 78,05%, E = 99,43%, k= 0,838, VPP = 58,04% e VPN = 99,78%. O limite de detecção mostrou reatividade até a diluição de 1/10.000 para EIE HCV Ab e EIE ETI-AB-HCVK-4 e até 1/1.000 com EIE Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA e EIE Murex HCV Ag/Ab Combination. Os resultados das amostras de SCPF obtiveram erro total inferior a 17% e as mesmas mantiveram-se estáveis nas diferentes condições de armazenamento por 60 dias. Os resultados obtidosnos EIE HCV ab e EIE Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA mostraram-se mais concordantes com os observados com as amostras de soro, indicando melhor desempenho desses ensaios em amostras de SCPF.
Abstract: The present study aims at adaptation of commercial enzyme immunoasssays for diagnosis of hepatitis C to be used with dried blood spots (DBS). Paired serum and DBS samples from 411 individuals with mean age of 40 years, were collected at Blood Center and three out patient units. Samples were tested for the detection of anti-HCV antibodies by using two enzyme immunoassays (EIAs): HCV Ab, Radim (Italy) and ETI-AB-HCVK-4, DiaSorin (Italy); and two EIAs for the simultaneous detection of hepatites C virus (HCV) core antigen and anti-HCV antibodies: Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA, Bio-Rad (France) and Murex HCV Ag/Ab Combination, Abbott (South Africa). Anti-HCV detection and simultaneous detection of HCV core antigen and anti-HCV antibodies in serum sample were perfomed according to the manufacture’s recommendations. In DBS samples parameters such as elution buffer, sample, diluent, and conjugate volumes, incubation period, and cut off (CO) values were evaluated. After optimization of these parameters, values of sensitivity, specificity, inter-rater agreement (kappa value), detection limit, intra- and inter-assay precision were determinated. Stability of DBS samples was investigated in different conditions (22-26ºC, 2-8°C e -20°C). As results, PBS/BSA 0,5% buffer was chosen as elution buffer in DBS samples and an increased volume of the samples in all EIAs was established. Incubation duration and volume of conjugate were in accordance with manufacturer’s recommendations. With EIA HCV Ab values sensitivity of 97,50%, specificity 99,46%, inter-rate agreement 0,959, positive predictive value 64,59%, and negative predictive value (1% of disease prevalence) 99,97% were observed. For the EIA ETI-AB-HCVK-4 best cut-off values were obtained from ROC curve and observed values were sensitivity 88,89%, specificity 98,89%, inter-rate agreement 0,875, positive predictive value 44,71%, and negative predictive value 99,89%. For the EIA Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA best cut-off values were obtained from ROC curve with sensitivity of 95,12%, specificity 100%, inter-rate agreement 0,959, positive predictive value 100%, and negative predictive value 99,95%. For the EIA Murex HCV Ag/Ab Combination best cut-off values were obtained by calculating the average of optical density of DBS samples correspondent to those with negative results in serum plus three standard deviations, resulting in a sensitivity of 78,05%, specificity of 99,43%, inter-rate agreement of 0,838, positive predictive value of 58,04%, and a negative predictive value of 99,78%. The lower limit of HCV Ab and ETI-AB-HCVK-4 tests in DBS was 1/10.000, and for Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA and Murex HCV Ag/Ab Combination was 1/1.000. Total error of DBS results was below 17% and all DBS samples maintained stable in all storage conditions for 60 days. Results obtained with EIE HCV Ab and EIA Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA were found to be more concordant with those observed for serum samples, indicating a better performance of theses assays inDBS samples.
Keywords: Hepatitis C
Diagnosis
Blood collected on filter paper
keywords: Hepatite C
Diagnóstico
Sangue coletado em papel de filtro
DeCS: Hepatite C
Diagnóstico
Issue Date: 2011
Publisher: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos.
Citation: BRANDÃO, Camille Petruccio Urago. Adaptação de métodos imunoenzimáticos de diagnóstico da hepatite C para uso com amostras de sangue coletado em papel de filtro. 2011. 105 f. Dissertação (Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiológicos) – Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2011.
Date of defense: 2011
Place of defense: Rio de Janeiro / RJ
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos.
Program: Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiológicos.
Copyright: open access
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