Análise da modulação e parceiros de interação das modificações pós-traducionais de histonas em Trypanosoma cruzi

Abstract

Modificações pós-traducionais de histonas (histone post-translational modifications, hPTMs) constituem um dos principais mecanismos reguladores do estado da cromatina nos eucariotos, influenciando processos como transcrição e reparo de DNA. Recentemente, a presença de diferentes hPTMs foi descrita em T. cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, sugerindo que um código de histonas regule a sua cromatina. No entanto, como essas hPTMs são moduladas em condições ambientais importantes no seu ciclo de vida, como durante o estresse nutricional e quais são os parceiros ligantes que as reconhecem, são questões importantes na elucidação dos mecanismos de regulação epigenética de T. cruzi e outros tripanossomatídeos. O protocolo aqui otimizado na identificação de hPTMs, permitiu a identificação de 201 marcas de hPTMs de 13 tipos distintos, nas histonas canônicas, variantes e linker de T. cruzi na sua forma epimastigota em fase exponencial, sendo que 107 destas marcas de histonas foram descritas pela primeira vez, expandindo o número conhecido de hPTMs em quase 2 vezes nesse tripanossomatídeo. Em seguida, o protocolo foi empregado para identificar as hPTMs e analisar sua regulação ao longo das condições exponencial (Epi-3d), estacionário (Epi-5d) e sob estresse nutricional durante 2h (St-2h) e 6h (St-6h) na forma epimastigota de T. cruzi. As histonas H2A, H2B, H3 e H3.V apresentaram diferença de abundância entre as condições Epi-3d e St-6h e entre St-2h e St-6h. Os tipos de hPTMs com maior nível global foram monometilação e acetilação e a dimetilação, trimetilação e crotonilação apresentaram diferença significativa entre condições envolvendo St-6h. Um total de 16 peptídeos das histonas H2A, H2B, H3, H4, H2A.Z e H3.V, com um total de 20 hPTMs, apresentaram modulação entre as diferentes condições. Dentre os grupos modulados, destacam-se as acetilações da N-terminal da H2A.Z que aumentaram significativamente de abundância ao longo das condições Epi-3d até St-6h. Em seguida, empregando uma abordagem baseada em XL-MS, o subproteoma e o interatoma do núcleo de epimastigotas de T. cruzi foram analisados. A análise do subproteoma da fração enriquecida de núcleos do parasito permitiu a identificação de um total de 1303 proteínas, sendo que 576 (44,2%) possuem localização nuclear de acordo com sua ontologia gênica. Estas proteínas nucleares são funcionalmente relacionadas com ligação de ácidos nucleicos, ribossomo, helicases, subunidades da RNA polimerase II (pol II) e histonas, constituindo o mais amplo estudo do subproteoma nuclear em T. cruzi. A análise do interatoma nuclear mostrou que 254 proteínas possuem anotação de interação na base de dados STRING. A análise da subrede envolvendo histonas revelou a interação direta das histonas com outras 42 proteínas identificadas, dentre elas as subunidades da pol II, fatores de transcrição e proteínas com domínios ligantes de cromatina. A análise de proteínas interagindo via crosslink (XL-MS) identificou 37 proteínas, dentre elas as histonas H1, H2B e H3. A histona H1 foi identificada em uma espécie de complexo envolvendo outras 10 proteínas, dentre elas uma proteína que apresenta um bromodomínio e um sítio acetilado na C-terminal. A H2B foi identificada interagindo com uma proteína “hipotética” com domínio ENTH/VHS e interage com outras cinco proteínas. A H3 foi identificada interagindo com uma proteína contendo cinco domínios RRM, uma possível RNA-binding protein. Interessantemente, a presença de PTMs (mono, di-, trimetilação e crotonilação) foi detectada em 13 das proteínas identificadas interagindo via crosslinking. Por fim, os resultados apresentados contribuem para se compreender os mecanismos epigenéticos de T. cruzi.