Análise proteômica para a identificação de receptores fagocíticos de alta afinidade contra resíduos manosilados da parede celular fúngica

Abstract

As micoses têm emergido nas últimas décadas dentre as principais causas de enfermidades humanas, particularmente em indivíduos sob risco constante de infecção. Devido à ausência de especificidade para um determinado hospedeiro, os fungos são capazes de causar doenças em múltiplas espécies animais. Estes microrganismos são capazes de interagir com hospedeiros ambientais, como a espécie de ameba de vida livre Acanthamoeba castellanii e macrófagos de diversas espécies, encontrando no interior destes, um ambiente propício para proteção, sobrevivência e disseminação. Nosso grupo descreveu a importância do receptor de manose (MR), identificado na superfície amebóide, como uma das principais vias de ligação fúngica. Na literatura, o receptor de manose também é descrito por sua participação na interação entre fungos e macrófagos. Assim, é possível estabelecer uma relação de similaridade entre amebas e macrófagos, não apenas por compartilharem propriedades de estrutura celular, motilidade, fisiologia e captura por emissão de pseudópodos e fagocitose, mas também pelo semelhante mecanismo de interação com microrganismos, apontando para possível evolução convergente dos receptores envolvidos. Diante disso, investigamos as proteínas de superfície, presentes em A. castellanii e macrófagos murinos, afim de encontrar possíveis candidatos à receptores de alta afinidade contra manoproteínas e mananas de parede celular fúngica. Inicialmente, após biotinilação das superfícies de ambas as células, processamos extratos contendo as proteínas de superfície de A. castellanii e macrófagos, que apresentaram um perfil proteico variando entre 10-250 KDa. Determinamos a ligação dessas proteínas aos fungos patogênicos Candida albicans, Cryptococcus neoformans e Histoplasma capsulatum. Confirmamos que os extratos de macrófagos apresentaram maior intensidade de ligação quando comparados aos extratos de amebas, apontando para a maior complexidade proteica de macrófagos em relação à superfície amebóide no mecanismo de interação com microrganismos. A partir disso, buscamos investigar as proteínas, presentes nesses extratos, que apresentavam afinidade por manose. Realizamos a purificação dos extratos protéicos de A. castellanii e dos macrófagos (RAW 264.7) por cromatografia de afinidade, em coluna de manose, além da confirmação por Western blot da presença desta lectina no extrato. Observamos afinidade dos extratos por ambos manose e mananas. Assim, direcionamos a nossa procura realizando o enriquecimento dos extratos de A. castellanii e macrófagos com manose. Analisamos os extratos enriquecidos por Western Blot, onde identificamos nos extratos de A. castellanii proteínas de, aproximadamente, 150 kDa, 75 kDa, 55 kDa e 35 KDa. Já nos extratos enriquecidos de macrófagos foram identificadas proteínas entre 50 e 170 KDa, além de bandas de menores pesos moleculares. Os extratos enriquecidos foram incubados com os fungos, para caracterizar as proteínas com capacidade de reconhecimento fúngico e os coprecipitados foram avaliados por espectometria de massas. Para determinar a importância desta lectina ligadora de manose na interação, realizamos ensaios de fagocitose, na presença e ausência de manose, caracterizando a importância deste receptor. Porém encontramos baixas porcentagens de inibição nos experimentos com macrófagos, concluindo que provavelmente, diferentemente das amebas, diversos outros receptores podem participar do mecanismo de interação, de forma compensatória, destacando a importância deste tipo de interação para cada espécie de hospedeiro e a possível diversidade. Os dados sugerem que, provavelmente, ocorre a evolução e o surgimento de outras vias de interação em hospedeiros superiores. Futuramente, após obtenção dos dados de caracterização de proteínas com alta afinidade por manose em ambos os organismos por espectrometria de massas, pretendemos realizar a construção, produção e caracterização de lectinas-Fc, utilizando sequências da lectinas identificadas na fusão com a porção Fc efetora de imunoglobulinas murinas. Como manoproteínas e mananas estão presentes universalmente na parede celular fúngica, estas proteínas quiméricas permitiriam o reconhecimento dos fungos por receptores Fc (FcR) presentes na superfície dos fagócitos, promovendo mecanismos de imunidade (inata e celular) e de ação antifúngica.