Avaliação da Reprodutividade das reações e da estabilidade dos kits Nested-PCR em tubo único e Multiplex-PCR para aplicação no diagnóstico de peste

Abstract

A peste, infecção pela Yersinia pestis, é considerada pela Organização Mundial de Saúde como uma doença re-emergente, que pode causar impacto na saúde publica e a Y. pestis está classificada como agente classe A de bioterrorismo. O diagnóstico bacteriológico constitui o gold standard para o diagnóstico da peste, entretanto ele pode ser prejudicado por conservação e transporte inadequados das amostras, dos locais de coleta para os laboratórios de diagnóstico. Diante disso, estão sendo avaliados métodos moleculares de diagnóstico que possam ser utilizados no monitoramento das áreas focais e controle em condições emergenciais. O objetivo desse trabalho foi avaliar a reprodutibilidade das reações e a estabilidade de um kit Nested-PCR em tubo único (NPCRTbU), em que os primers internos são fixados no interior da tampa do tubo de reação, tendo como alvo o gene caf1 e de um outro kit baseado na técnica de Multiplex-PCR (M-PCR), que tem como alvo os genes caf1, lcrV, pla e irp2. Esses kits contêm todos os componentes da mistura de reação incluindo a enzima Taq polimerase. O DNA alvo e a água são adicionados no momento do uso. Para avaliar a melhor condição de estocagem foram preparadas duas séries de tubos: (1) para reações individuais e (2) pool para 10 reações. Os tubos foram estocados a -20°C e testados mensalmente. Para avaliar a reprodutibilidade, as reações foram realizadas em duplicata e o índice de Kappa de Cohen foi utilizado para análise estatística. Para avaliar a melhor condição de transporte foram simuladas duas condições: (1) congelamento em gelo seco e (2) liofilização dos reagentes após adição de trealose como estabilizador enzimático. Os kits foram testados por 12 meses, mantendo-se estáveis e em condições adequadas para uso. A liofilização se mostrou melhor que a refrigeração para o transporte. O N-PCRTbU oferece maior especificidade enquanto a MPCR permite também a caracterização dos fatores de virulência da cepa isolada ou presente no material biológico. A disponibilidade de kits prontos para uso é de grande importância para descentralização do diagnóstico da doença, aumentando assim a eficiência das atividades de controle e vigilância no Brasil .