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2025-04-27
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DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE PLATAFORMAS DO TIPO "POINT-OF-CARE" PARA O DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ARBOVÍRUS EMERGENTES
Chikungunya
Infecção pelo Zika virus
Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa
Técnicas Biossensoriais
Culicidae
Custos e Análise de Custo
Estudos de Avaliação
Sensibilidade e Especificidade
Insetos Vetores
Técnicas e Procedimentos Diagnósticos
Chikungunya
Zika virus infection
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
Biosensory Techniques
Culicidae
Costs and Cost Analysis
Assessment Studies
Sensitivity and Specificity
Insects Vectors
Diagnostic Techniques and Procedures
Chikungunya
Infección por el virus del Zika
Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
Técnicas Biosensoriales
Culicidae
Costos y análisis de costos
Estudios de evaluación
Sensibilidad y especificidad
Vectores de insectos
Técnicas y procedimientos de diagnóstico
Infecção pelo Zika virus
Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa
Técnicas Biossensoriais
Culicidae
Custos e Análise de Custo
Estudos de Avaliação
Sensibilidade e Especificidade
Insetos Vetores
Técnicas e Procedimentos Diagnósticos
Silva, Severino Jefferson Ribeiro da | Date Issued:
2021
Advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Departamento de Veterinária. Universidade Federal de Viçosa. Viçosa, MG, Brasil.
Universidade Federal de Pernambuco. Recife, PE, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Departamento de Veterinária. Universidade Federal de Viçosa. Viçosa, MG, Brasil.
Universidade Federal de Pernambuco. Recife, PE, Brasil.
Abstract in Portuguese
As arboviroses, como as provocadas pelo o vírus Zika (ZIKV) e o vírus chikungunya (CHIKV), têm sido associadas a surtos em larga escala e epidemias em vários países de clima tropical e subtropical nos últimos anos. Atualmente, o diagnóstico dos pacientes infectados por estes vírus é realizado em laboratórios centralizados utilizando a reação de transcriptase reversa seguida da reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR), que, embora seja o método molecular padrão-ouro para o diagnóstico molecular, tem várias desvantagens para uso em áreas remotas e de poucos recursos, como alto custo e necessidade de equipamentos especializados. Essas desvantagens dificultam a aplicação e utilização para um grande número de amostras. As plataformas de diagnóstico point-of-care (POC) têm o potencial de superar essas limitações, especialmente em países em desenvolvimento. Com isso em mente, nós desenvolvemos e validamos duas plataformas de diagnóstico baseadas em RT-LAMP e biossensores moleculares para a detecção rápida do ZIKV e CHIKV em amostras de pacientes e amostras de mosquitos. O RT-LAMP foi capaz de detectar o ZIKV em diversos tipos de amostras (soro, urina, saliva e sêmen) em apenas 20 minutos, sem extração de RNA. O ensaio RT-LAMP foi altamente específico e até 100 vezes mais sensível do que RT-qPCR. Em seguida, validamos o ensaio com 100 amostras de soro de pacientes coletadas de casos suspeitos de infecção por arbovírus no estado de Pernambuco, epicentro da última epidemia de Zika. Comparado com a RT-qPCR, o ensaio RT-LAMP forneceu sensibilidade de 100%, especificidade de 93,75% e uma precisão geral de 95,00%. Por outro lado, os biossensores moleculares apresentaram sensibilidade similar e alta especificidade quando comparado a RTqPCR. Na sequência, validamos os biossensores com 268 amostras clínicas e as análises demonstraram sensibilidade de 94,52%, especificidade de 100% e uma precisão geral de 98,51%. Demonstrando a programabilidade e extensibilidade de ambas as plataformas de diagnóstico, alcançamos um desempenho de diagnóstico semelhante para a detecção do CHIKV em soro, saliva, urina e amostras de mosquitos. Por fim, também foi otimizado um método alternativo de extração do RNA baseado em fervura acoplado a técnica de RT-qPCR para a detecção molecular do ZIKV. Tomados em conjunto, o ensaio RT-LAMP e os biossensores moleculares fornecem duas alternativas promissoras e de baixo custo para o diagnóstico rápido do ZIKV e CHIKV e possuem o potencial de aumentar a capacidade diagnóstica em áreas afetadas por estes arbovírus emergentes, particularmente em países com baixa infraestrutura laboratorial.
Abstract
Arboviruses such as those caused by the Zika virus (ZIKV) and the chikungunya virus (CHIKV) have been associated with large-scale outbreaks and epidemics in several tropical and subtropical countries in recent years. Currently, the diagnosis of patients is performed in centralized laboratories using the reverse transcriptase reaction followed by the quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), which, although it is the gold standard molecular method for molecular diagnosis, has several disadvantages for use in remote areas with low resources, such as high cost and need for specialized equipment. These drawbacks make it difficult to apply and use for a large number of samples. Point-of-care (POC) diagnostic platforms have the potential to overcome these limitations, especially in developing countries. With this in mind, we developed and validated two assays including RT-LAMP and molecular biosensors for the rapid detection of ZIKV and CHIKV in patient and mosquito samples. RTLAMP was able to detect ZIKV in several types of samples (serum, urine, saliva and semen) in just 20 minutes, without RNA extraction. The RT-LAMP assay was highly specific and up to 100 times more sensitive than RT-qPCR. Then, we validated the assay with 100 serum samples from patients collected from suspected cases of arbovirus infection in the state of Pernambuco, the epicenter of the last Zika epidemic. Analysis of the results, compared to RT-qPCR, found that the RT-LAMP assay provided sensitivity of 100%, specificity of 93.75% and overall accuracy of 95.00%. On the other hand, molecular biosensors showed similar sensitivity and high specificity when compared to RT-qPCR. Then, we validated the biosensors with 268 clinical samples and the analyzes showed sensitivity of 94.52%, specificity of 100% and an overall accuracy of 98.51%. Demonstrating the approach’s programmability and extensibility, we then achieved similar diagnostic performance for the detection of CHIKV in serum, saliva, urine, and mosquito samples. Finally, an alternative method of RNA extraction based on boiling coupled with the RT-qPCR technique was also optimized for the molecular detection of ZIKV. Taken together, the RT-LAMP assay and molecular biosensors provide two promising and lowcost alternatives for the rapid diagnosis of ZIKV and CHIKV and have the potential to increase diagnostic capacity in areas affected by these emerging arboviruses, particularly in countries with low laboratory infrastructure.
Keywords in Portuguese
Zika virusChikungunya
Infecção pelo Zika virus
Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa
Técnicas Biossensoriais
Culicidae
Custos e Análise de Custo
Estudos de Avaliação
Sensibilidade e Especificidade
Insetos Vetores
Técnicas e Procedimentos Diagnósticos
Keywords
Zika virusChikungunya
Zika virus infection
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
Biosensory Techniques
Culicidae
Costs and Cost Analysis
Assessment Studies
Sensitivity and Specificity
Insects Vectors
Diagnostic Techniques and Procedures
Keywords in Spanish
virus zikaChikungunya
Infección por el virus del Zika
Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
Técnicas Biosensoriales
Culicidae
Costos y análisis de costos
Estudios de evaluación
Sensibilidad y especificidad
Vectores de insectos
Técnicas y procedimientos de diagnóstico
DeCS
Zika virusInfecção pelo Zika virus
Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa
Técnicas Biossensoriais
Culicidae
Custos e Análise de Custo
Estudos de Avaliação
Sensibilidade e Especificidade
Insetos Vetores
Técnicas e Procedimentos Diagnósticos
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