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Title: Caractetização proteica do fluido aspirado de mama de pacientes brasileiras com câncer de mama unilateral
Advisor: Ferreira, Ana Gisele da Costa Neves
Members of the board: Bozza, Patricia Torres
Gallo, Claudia Vitoria de Moura
Domont, Gilberto Barbosa
Barboza, Luciana Pizzatti
Valente, Richard Hemmi
Authors: Brunoro, Giselle Villa Flor
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil
Abstract: O câncer de mama é a principal causa de morte por câncer em mulheres no mundo. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer, 7.470 novos casos são estimados em 2010 apenas no Rio de Janeiro. A maioria dos casos de câncer de mama são originados nas células ductais mamárias. Elas secretam o fluido aspirado de mama (NAF), que contém proteínas intimamente associadas ao microambiente tumoral. O objetivo deste trabalho foi utilizar a abordagem proteômica como ferramenta para caracterizar e comparar o NAF das duas mamas de pacientes brasileiras com câncer da mama unilateral. A concentração média de proteínas das amostras controle, tumor benigno ou câncer de mama de 13 mulheres foi aproximadamente 115 ± 60 μg/μL. A atividade proteolítica do NAF foi visualizada por zimografia das amostras de duas pacientes. Observamos que o padrão de bandas gelatinolíticas diferiu substancialmente entre as pacientes, mas não entre as duas mamas do mesmo indivíduo. As enzimas proteolíticas se apresentaram sensíveis à inibição por agentes quelantes de metais (EDTA e orto-fenantrolina). As amostras de NAF também foram submetidas à 2D-PAGE em condições otimizadas (IPG 4-7 e aplicação de amostra por reidratação in gel) e poucos spotsproteicos muito abundantes foram detectados e identificados por espectrometria de massas MALDI-TOF/TOF como albumina, imunoglobulinas, zinco-α2-glicoproteína e proteína induzida por prolactina. Para enriquecer o NAF em suas proteínas menos abundantes, testamos estratégias de depleção usando a coluna de múltipla afinidade Hu-6 da Agilent ou proteína L agarose. Este passo de pré-fracionamento introduziu variabilidade adicional importante nas amostras e por este motivo não foi empregado em etapas posteriores do estudo. Catorze amostras de NAF das mamas pareadas de mulheres com câncer unilateral foram sistematicamente comparadas por 2D-DIGE. Foram observadas diferenças qualitativas substanciais entre as pacientes, prejudicando as comparações quantitativas entre as amostras. Dois grandes perfis proteicos distintos foram definidos por 2D-DIGE. O perfil A caracterizou-se pela presença de dois grupos de spotsácidos típicos (pI ≈ 4,5 e MM 29,5 e 18 kDa), ausentes no perfil B. A presença de glico- e fosfo-proteínas foi determinada em amostras de ambos os perfis após revelação dos géis 2D com ProQ- Emerald ou Diamond,respectivamente. As amostras dos dois perfis se mostraram muito mais ricas em glicoproteínas do que em fosfoproteínas. Este trabalho constituiu a primeira caracterização proteômica sistemática do NAF de pacientes brasileiras com câncer de mama unilateral. Nossos resultados mostraram uma variabilidade importante do conteúdo de proteínas nas amostras individuais de NAF, sugerindo a necessidade de uma estratificação mais uniforme daspacientes. Por fim, o emprego de tecnologias proteômicas mais sensíveis e acuradas deverá ser necessário para possibilitar a detecção e identificação de proteínas menos abundantes no NAF, que poderão constituir candidatos a biomarcadores do câncer de mama.
Abstract: Breast cancer is the main cause of cancer deaths worldwide in women. According to the Instituto Nacional do Câncer, 7.470 new cases are estimated for 2010 in Rio de Janeiro. Most breast cancer cases originate from mammary ductal cells that secrete the nipple aspirate fluid (NAF), witch contains proteins associated with the breast cancer microenvironment. The aim of this study was to use the proteomic approach as a reliable tool to characterize NAF samples from brazilian patients with unilateralbreast cancer. The mean concentration of NAF proteins from healthy, benign or cancer breast samples from 13 women was approximately 115 ±60 μg/μL. The proteolytic activity of NAF samples from both breasts of two patients was visualized by SDS-PAGE zymography.The patterns of gelatinolytic bands differed substantially between patients but were very similar within the same patient. The proteolytic activity was sensible to inhibition by metal quelators (EDTA and orthophenantrolin). In this study, NAF samples weresubmitted to 2D-PAGE under optimized conditions (IPG 4-7 and sample in gel rehydratation) and a few very abundant protein spots were detected. They were identified by MALDI-TOF/TOF MS as albumin, immunoglobulins, zinc-α2-glycoprotein and prolactin-induced protein.To enrich NAF for less abundant proteins, we tested protein depletion using AgilentHu-6 column or Protein L Agarose. These pre-fractionation steps introduced important additional variability in the samples and were not further used. Fourteen NAF samples from tumorous and non-tumorous breasts of women with unilateral cancer were systematically compared by 2D-DIGE. Substantial qualitative individual differences were observed, impairing proper quantitative comparisons. Two main 2D-DIGE protein profiles were observed: profile A was characterized by two groups of acidic spots (pI ≈ 4,5 and MM 29,5 and 18kDa), not detected in profile B. The presence of glyco- and phosphoproteins was determined after staining NAF 2D gels with ProQ-Emerald or Diamond, respectively. The samples from both profiles were much richer in glycoproteins than phosphoproteins. This work was the first systematic proteomic characterization of NAF from brazilian patients with unilateral breast cancer. The results highlight important variability in the protein content of NAF samples, suggesting that a more uniform patient stratification and the use of more sensible and accurate proteomic technologies will be needed for the detection and identification of breast cancer biomarker candidates.
DeCS: Câncer
Mama
Proteômica
NAF
Issue Date: 2010
Citation: BRUNORO. G. V. F. Caracterização proteica do fluido aspirado de mama de pacientes brasileiras com câncer de mama unilateral. 2010. 104 f. Dissertação(Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2010
Date of defense: 2010-05-07
Place of defense: Rio de Janeiro/Rj
Department: Instituto Oswaldo Cruz
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: restricted access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Dissertações de Mestrado

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