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2026-05-03
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DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE CONTROLES PLASMIDIAIS PARA O DIAGNÓSTICO MOLECULAR E DETECÇÃO DA DOENÇA RESIDUAL NA LEUCEMIA INFANTIL
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Development and evaluation of control plasmids for molecular diagnosis and minimal residual disease detection in childhood leukemiaAuthor
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Abstract in Portuguese
As leucemias infantis são associadas a alterações genéticas que desencadeiam a transformação leucêmica nas células acometidas. Essas alterações são importantes para o diagnóstico, pois integram um quadro que leva a escolha do melhor tratamento para o paciente, mas também permitem que seja feito o acompanhamento da resposta ao tratamento. A quantificação da doença residual mínima (células leucêmicas remanescentes) atualmente é feita utilizando técnicas como a imunofenotipagem por citometria de fluxo e a reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificação gênica em tempo real (qPCR). Mesmo sendo bastante conhecida e utilizada nos laboratórios, o uso da qPCR para o diagnóstico e acompanhamento dos pacientes com leucemia é limitado no Sistema Único de Saúde. Portanto, o principal objetivo do presente trabalho foi desenvolver e avaliar controles plasmidiais de alterações genéticos para o diagnóstico molecular e acompanhamento dos pacientes com leucemias. Para isso, os controles positivos (plasmídeos) foram construídos utilizando produto de PCR das diferentes alterações genéticas e vetor comercial. Além das quimeras, em todos os plasmídeos foram incluídos fragmentos de genes de referência GUSB e ABL, para facilitar o cálculo do número de cópias normalizado. Após a construção, os plasmídeos foram extraídos e purificados em coluna de sílica. Com os plasmídeos prontos, eles foram avaliados em reações de qPCR. Os oligonucleotídeos e as sondas utilizados foram descritos por Gabert e colaboradores (2003) e as reações foram otimizadas para o equipamento QuantStudio5. Para construção das curvas padrões, foram utilizadas diluições seriadas de 1:10 com o intuito de definir o ciclo em que a curva cruza o limiar de detecção (Ct, do inglês cycle threshold) para cada ponto da diluição, bem como as eficiências das reações, limites de detecção e de quantificação. Foram também avaliados se os plasmídeos contendo alvo e referência na mesma sequência teriam grandes variações de número de cópias. Neste estudo, foram construídos vinte e três plasmídeos. Dos vinte e três, sete foram avaliados em reações de PCR. Com os resultados obtidos após as reações, observamos que os diferentes alvos apresentaram eficiências entre 90% e 100%. As reações se mantiveram estáveis e sem grandes variações em torno da média dos Cts que foram determinados, mesmo para os pontos mais diluídos da curva. Foi também observado que os limites de detecção e de quantificação eram diferentes em número de cópias. E que o número de cópias normalizado entre alvo/referência é bem próximo de 1. Concluída esta parte do trabalho, o material produzido foi encaminhado para o Núcleo de Inovação Tecnológica do Instituto Aggeu Magalhães para o estudo de viabilidade patentária.
Abstract
Childhood leukemia is associated with genetic variation which may initiate the leukemic transformation in a sort type of cell. These genetic variations are important to the diagnosis not only because they help lead to a better choice of treatment for the patients, but they also allow monitoring the response to the treatment. The quantification of minimal residual disease (reminiscent leukemic cells) is based on immunophenotyping by flow cytometry or in the polymerase chain reaction (PCR) to the real-time genetic amplification (qPCR). However, even though qPCR technique is very known and used daily in the laboratories, its use to the diagnosis and monitoring of patients with leukemia is very limited in the public health system of Brazil. Therefore, we aimed to develop and evaluate control plasmids of different abnormal genetic variation, so it can be used to the molecular diagnosis and the monitoring of patients with leukemia. First, the plasmid controls were constructed using PCR fragments of different abnormal genetic variation and commercial vectors. Besides the quimeric genes, in all plasmids was inserted a fragment of endogenous genes GUSB and ABL, turning easiest the calculation of normalized copy number. After the construction, the plasmids were extracted and purified using silica column. The plasmids were evaluated in PCR reactions. The primers and probes used were described by Gabert et al., 2003 and the reactions were optimized for the QuantStudio 5 equipment. To the standard curves, it was used serial diluted 1:10 aiming to know in which cycle the curve exceeds the threshold (cycle threshold, Ct) for each point of the dilution, as well as the limit of detection and quantification. It was also evaluated if the plasmid with the target and reference genes had variation of copy number. In this study, it was constructed twenty- three plasmids. Seven of these were evaluated in real-time PCR. With the results, we observed that the different targets had an efficiency between 90% and 100%. It was also observed that the limits of detection and quantification were different in copy number. The normalized copy number between target and references was close to 1. After we concluded this part of the study, all the material produced was sent to the Technological Innovation Nucleus of Aggeu Magalhães Institute to do a study of patent viability.
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