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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/60677
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E FUNCIONAL DA ENZIMA UREASE (URE) DE SPOROTHRIX BRASILIENSIS
Oliveira, Luã Cardoso de | Date Issued:
2020
Author
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
No Rio de Janeiro observa-se uma hiperendemia de esporotricose, causada principalmente por Sporothrix brasiliensis. Espécies clínicas de S. brasiliensis, produzem urease, porém pouco se avançou no conhecimento desta. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a urease, verificar a expressão de seu gene e começar a entender seu possível papel na virulência. Foram utilizadas 2 cepas de S. brasiliensis, uma delas considerada produtora de urease e outra considerada não produtora de urease. Fenotipicamente, foi observado que apenas a cepa considerada urease positiva foi capaz de crescer em meio de cultivo cujo a ureia era a única fonte de nitrogênio, e quando esta foi cultivada em meio com inibidor tioureia apresentou pouco crescimento. Após, o extrato proteico foi submetido a ressonância plasmômica de superfície (SPR) e western blot para caracterizar a enzima bioquimicamente. A expressão gênica da urease foi verificada por qPCR e a comparação, in silico, entre a urease de S. brasiliensis, a de outros 20 fungos e de Canavalia ensiformis. A técnica de western blot não demonstrou reatividade na cepa negativa, já na SPR esta foi evidenciada nas duas cepas. A partir disto, foram realizadas reações de qPCR para verificar a expressão gênica do gene codificador da urease nas duas cepas, e em ambas o RNA mensageiro para urease está presente. Foi comparada, através de ferramentas de bioinformática, as sequencias de urease de 21 fungos e de C. ensiformis, e a urease se mostrou uma enzima bem conservada entre as espécies analisadas, e parece ser, corroborando com os achados in vitro uma enzima que se localiza no citoplasma celular. Os achados nesta tese, indicam que a urease provavelmente é um gene constitutivo neste modelo fúngico, e muito importante para o crescimento celular do S. brasiliensis, pois em condições inibitórias da enzima o fungo foi incapaz de crescer normalmente. Esses dados, juntamente com a demonstração da alta preservação desta enzima nos fungos, sugerem que a urease é importante para a fisiologia do S. brasiliensis em parasitismo
Abstract
In Rio de Janeiro there is a hyperendemia of sporotrichosis, caused mainly by Sporothrix brasiliensis. Clinical species of S. brasiliensis, produce urease, but slight progress has been made in its field. The aim of this work was to characterize urease, to verify the expression of its gene and begin to understand its possible role in virulence. Two strains of S. brasiliensis were used, one of them considered a producer of urease and the other considered non-producer of urease. Phenotypically, it was observed that only the strain considered urease positive was able to grow in a culture medium which urea was the only source of nitrogen, and when it was cultivated in a medium with a thiourea inhibitor it showed little growth. Afterwards, the protein extract was submitted to surface plasmon resonance (SPR) and western blot to characterize the enzyme biochemically. The urease gene expression was verified by qPCR and the comparison, in silico, between the urease of S. brasiliensis, that of other 20 fungi and of Canavalia ensiformis. The western blot technique showed no reactivity in the negative strain, whereas in SPR it was found in both strains. From this, qPCR reactions were performed to check the gene expression of the urease encoding gene in both strains, and in both the messenger RNA for urease is present. The urease sequences of 21 fungi and C. ensiformis were compared using bioinformatics tools, and urease proved to be a well-preserved enzyme among the analyzed species, and it appears to be, corroborating with the in vitro findings an enzyme that locates in the cell cytoplasm. The findings in this thesis indicate that urease is probably a constitutive gene in this fungal model, and very important for the cellular growth of S. brasiliensis, because under enzyme inhibitory conditions the fungus was unable to grow normally. These data, together with the demonstration of the high preservation of this enzyme in fungi, suggest that urease is important for the physiology of S. brasiliensis in parasitism
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