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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/61843
TRNA LIGASE (TRL1) -LIKE DE TRYPANOSOMA BRUCEI: EFEITOS DO RNAI IN VIVO
Bruno, Roberta Eitler | Date Issued:
2012
Author
Advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
Doenças neligenciadas são definidas como um grupo de doenças infecciosas crônicas relacionadas com a pobreza que ocorrem principalmente em populações da América Latina, África e Ásia. Entre elas estão a Doença de Chagas, Doença do Sono e Leishmaniose, transmitidas por insetos e causadas pelos protozoários Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei e Leishmania sp., respectivamente. Em busca de conhecimento básico sobre a biologia do tRNA destes tripanossomatídeos e prevendo a possibilidade de descoberta de novos alvos terapêuticos foi estudado o pouco conhecido mecanismo de editoração de tRNAs em tripanossomatídeos. Dentre as enzimas envolvidas na maturação de tRNAs, estão as tRNA ligases, que efetuam a ligação dos éxons gerados após retirada do íntron pela ação de uma tRNA endonuclease. O produto do gene da putativa tRNA ligase dos tripanossomatídeos (trl1-like) não possui homologia com o gene da tRNA ligase humana, sendo um promissor alvo para droga. O gene trl1 (tRNA ligase) é essencial para a levedura S. cerevisiae, dessa forma, esse trabalho procurou caracterizar funcionalmente a tRNA ligase de tripanossomatídeos, analisando os domínios da enzima dos parasitos, investigando a essencialidade do gene trl1-like em T. brucei e observando a atividade da enzima de T. brucei in vitro. O alinhamento das sequências da tRNA ligase de classe I de tripanossomatídeos e leveduras confirmou que as sequências tratam-se de tRNA ligases, apresentando os três domínios: ligase, polinucleotídeo quinase e fosfodiesterase cíclica assim como os motivos conservados essenciais para o funcionamento da enzima. Para os ensaios in vivo, foi construído o plasmídeo pLew100-trl1-2 e transfectado em T. brucei procíclicos, para os ensaios de RNAi. Durante a indução do RNAi pode-se observar a inibição do crescimento do T. brucei, sempre a partir do quarto dia de indução. No entanto, nenhuma alteração no ciclo celular e na viabilidade dos parasitos foi verificada. O silenciamento gênico foi confirmado por qPCR, demonstrando diminuição da expressão do mRNA a partir de 48 h de indução. A enzima Trl1-like foi expressa e purificada in vitro sob diversas condições experimentais, no entanto não foi possível testar sua atividade devido a sua instabilidade in vitro. Esse trabalho permitiu demonstrar a importância da Trl1-like para a sobrevivência do T. brucei contribuindo para um maior entendimento da biologia dos tripanossomatídeos.
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