Avaliação do potencial quimioterápico do 17-DMAG utilizando diferentes abordagens terapêuticas no controle da infecção por Leishmania braziliensis

Abstract

INTRODUÇÃO: As leishmanioses são doenças negligenciadas causadas por parasitos do gênero Leishmania e endêmicas em 98 países. A leishmaniose cutânea, caracterizada pela presença de lesões na pele, apesar de não fatal, gera estigmatização, podendo afetar a qualidade de vida dos pacientes. Os tratamentos atuais apresentam limitações como a via de administração invasiva e a ocorrência de efeitos colaterais, evidenciando a necessidade de novos fármacos. Inibidores da Hsp90 da família da Geldanamicina, incluindo o 17-AAG e o seu análogo hidrossolúvel, 17-DMAG, vêm demonstrando ter potencial antiparasitário. Em estudos prévios, foi descrito que esses inibidores apresentam efeito anti-Leishmania in vitro. OBJETIVO: Avaliar o potencial terapêutico do 17-DMAG no controle da infecção por L. braziliensis in vitro e in vivo, usando formulações para aplicação por via sistêmica ou tópica, e desenvolver nanopartículas (NPs) para a liberação controlada deste fármaco. MATERIAL E MÉTODOS: A toxicidade do 17-DMAG sobre células de linhagem HaCaT, macrófagos derivados de medula óssea (BMMØ) e promastigotas axênicas de L. braziliensis foi avaliada in vitro, utilizando Alamar blue. Adicionalmente, a viabilidade de amastigotas intracelulares foi avaliada por contagem dos parasitos em câmara de Neubauer, em microscópio óptico, após 72 h de tratamento. Para os ensaios in vivo, camundongos BALB/c foram infectados na orelha com promastigotas metacíclicas de L. braziliensis e, após três ou cinco semanas de infecção, foram tratados por via intraperitoneal (IP) com o 17-DMAG ou com glicose, como controle, durante quatro semanas adicionais imunoinflamatória do hospedeiro e avalia A eficácia do composto administrado por via IP no controle da infecção foi avaliada iniciando o tratamento após três ou cinco semanas de infecção, com a caracterização da resposta imunoinflamatória do hospedeiro e avaliação de recidiva da carga parasitária após suspensão do tratamento. Paralelamente, hidrogel a base de carboximetilcelulose contendo diferentes concentrações do 17-DMAG foi preparado e caracterizado de acordo com sua estabilidade. A toxicidade da formulação tópica foi avaliada pelas observações clínicas e histopatológicas nas orelhas dos camundongos saudáveis, expostos por até quatro semanas com diferentes concentrações do 17-DMAG em hidrogel, comparados com os controles expostos ou não ao hidrogel sem fármaco. Em seguida, a eficácia foi avaliada em camundongos BALB/c infectados por L. braziliensis comparados com os animais controles, tratados ou não com o hidrogel branco. NPs poliméricas de poli (ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA) contendo ou não o 17-DMAG foram produzidas, utilizando dois protocolos de dupla emulsão (P1 ou P2), e caracterizadas de acordo com tamanho, índice de polidispersão (PdI), potencial zeta (ZP), formato, aspecto da superfície e eficiência de encapsulamento (%EE), por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). RESULTADOS: A concentração necessária para causar a morte de 50% das células foi respectivamente maior para HaCaT [13,68 μM (Q1: 10,03; Q3: 13,75)] e BMMØ (3,2 ± 1,06 μM) que para promastigotas (674,2 ± 0,07 nM) e amastigotas intracelulares (7,4 ± 3,27 nM) de L. braziliensis, indicando um potente efeito anti-Leishmania do 17-DMAG in vitro. O tratamento IP causou redução de 7 vezes na espessura da orelha, no tamanho do linfonodo e de 1000 vezes na carga parasitária nesses órgãos. Também foi observada redução do número de células no sítio da lesão, sugerindo uma diminuição do recrutamento de células nos animais tratados Um aumento transitório do percentual de linfócitos T regulatórios (T reg) no dia 7, comparado aos dias 4 e 28 de tratamento, foi observado, sugerindo que o fármaco exerce também um papel na resposta imunomodulatória do hospedeiro. O 17-DMAG em hidrogel foi estável, por 90 dias, a 4 °C ou à temperatura ambiente, mas não a 37 °C. O fármaco foi liberado desta formulação de forma controlada, de maneira tempo-dependente, ao longo de 24 h. Devido ao aumento do tempo de exposição, a aplicação tópica do 17-DMAG foi tolerável por camundongos saudáveis, com aumento da toxicidade quando em uso de colares elizabetanos. A exposição tópica ao 17-DMAG foi tolerável por camundongos saudáveis, com toxicidade aumentada quando em uso de colares elizabetanos, devido ao aumento do tempo de exposição. Nas doses de 0,10 ou 0,15 mg/g, comparado ao controle não tratado, o 17-DMAG em hidrogel reduziu cerca de 50% a espessura da orelha e contribui para a cicatrização das lesões. Por fim, as NPs produzidas pelo protocolo P2 apresentaram melhores características que o protocolo P1, com menores tamanhos e PdI, %EE entre 20 e 30%, formato esférico e superfície lisa. CONCLUSÃO: O 17-DMAG controla efetivamente a infecção in vitro e in vivo por L. braziliensis tanto quando aplicado por via intraperitoneal quanto por via tópica. Adicionalmente, PLGA-NPs com boas características foram produzidas para futuros testes de eficácia, in vitro e in vivo