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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/62737
ESTUDO COMPARATIVO DAS TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU E REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE-QUANTITATIVA (QPCR) PARA O DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO CUTÂNEA POR LEISHMANIA INFANTUM EM CÃES
Hibridização in situ
Leishmania Infantum
PCR Quantitativa
Hibridização In Situ
Leishmania infantum
Cães
Reação em Cadeia da Polimerase
Silva, Ricardo Gonçalves | Date Issued:
2018
Author
Advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
A leishmaniose visceral zoonótica é uma doença causada pelo protozoário Leishmania infantum e de grande importância em saúde pública no Brasil, que acomete humanos e mamíferos domésticos e silvestres. O diagnóstico da infecção por L. infantum em cães é feito por meio de técnicas laboratoriais, que devem ser acuradas, pois esses animais são a principal fonte de infecção para o vetor biológico no meio urbano. Amostras de pele fixadas em formalina tamponada a 10% e emblocadas em parafina (FFEP) são muito utilizadas na rotina para o diagnóstico da infecção por L. infantum em cães, por serem um bom alvo e prescindirem de condições ideais de refrigeração e transporte a campo. Muitas vezes essas são as únicas amostras disponíveis para o diagnóstico da espécie de Leishmania spp. Nesses casos, o diagnóstico a nível de espécie somente é possível pela utilização da técnica de hibridização in situ (ISH) e técnicas de PCR, como a PCR quantitativa (qPCR). Porém, a sensibilidade dessas técnicas em pele FFEP é pouco conhecida. Portanto, o objetivo desse estudo é determinar a sensibilidade das técnicas de ISH e qPCR em amostras de pele FFEP para o diagnóstico da infecção por L. infantum em cães usando amostras de pele positivas na cultura parasitológica (CP) como método padrão de referência. Amostras de pele FFEP de 48 cães, 27 com presença de sinais clínicos e 21 com ausência de sinais clínicos, com infecção cutânea para L. infantum confirmada na CP e eletroforese de enzimas multilocus, foram examinadas pelas técnicas de ISH e qPCR usando sondas específicas para L. infantum . Essas amostras foram coletadas por biopsia de pele íntegra da região escapular de cães de diferentes áreas endêmicas no Brasil, entre 2008 e 2015. A técnica de ISH foi examinada por dois observadores com diferentes experiências em microscopia óptica. As sensibilidades encontradas para as técnicas de qPCR e ISH foram respectivamente 77% e 58%. As sensibilidades da técnica de qPCR em cães com presença de sinais clínicos e ausência de sinais clínicos foram 70,4% e 85,7%, respectivamente. As sensibilidades da técnica de ISH em cães com presença de sinais clínicos e ausência de sinais clínicos foram 55,5% e 62%, respectivamente. A concordância interobservadores na técnica de ISH foi suave (Kappa=0,32). ISH apresentou sensibilidade diretamente associada à carga parasitária quantificada de L. infantum na pele. As técnicas de ISH e qPCR apresentaram sensibilidades satisfatórias no diagnóstico da infecção por L. infantum em amostras de pele de cães FFEP, inclusive em cães com ausência de sinais clínicos, sendo a qPCR a técnica mais sensível. Quando utilizadas em conjunto, essas duas técnicas aumentam a sensibilidade do diagnóstico de L. infantum na pele FFEP de cães e permitem a identificação de infecções ativas por esse parasito
Abstract
The zoonotic visceral leishmaniasis (ZVL) is a disease caused by the protozoan Leishmania infantum and of great importance in public health in Brazil, which affects humans, domestic and wild mammals. The diagnosis of L. infantum infection in dogs is perfomed by laboratory techniques, which must be accurate, because these animals are the main source of infection for the biological vector in the urban environment. Formalin-fixed, paraffin-embedded skin samples (FFPE) are frequently used in laboratorial routine for the diagnosis of infection by L. infantum in dogs, because are a good target and do not need ideal conditions of cooling and transportation in the field. These are often the only samples available for the diagnosis of Leishmania spp. In these cases, the diagnosis at species level is only possible by in situ hybridization (ISH) and PCR techniques, as quantitative PCR (qPCR). However, the sensitivity of these techniques is little known. Therefore, the aim of this study was to determine the sensitivity of ISH and qPCR in FFPE skin samples for the diagnosis of L. infantum infection in dogs using skin samples positive by parasitological culture (PC) as the reference standard. FFPE skin samples of 48 dogs (27 with clinical signs and 21 without clinical signs) having cutaneous infection by L. infantum confirmed by PC and by multilocus enzyme electrophoresis were examined by ISH and qPCR using specific probes for L. infantum. These samples were collected by biopsy of healthy skin of scapula in dogs from different endemic areas of ZVL in Brazil, between 2008 and 2015. The ISH technique was examined by two observers with different experiences in light microscopy. The sensitivities of qPCR and ISH were, respectively, 77.0% and 58.0%. The sensitivities of qPCR in dogs with and without clinical signs were, respectively, 70.4% and 85.7%. The sensitivities of ISH in dogs with and without clinical signs were, respectively, 55.5% and 62.0%. The interobservers agreement for the ISH was fair (Kappa=0.32). The ISH presented sensitivity directly associated with parasitic load quantified of L. infantum in the skin. The ISH and qPCR showed satisfactory sensitivities for the diagnosis of L. infantum in FFPE skin samples of dogs, even in dogs without clinical signs, being qPCR the most sensitive technique. When used together, these two techniques increase the sensitivity for L. infantum diagnosis in the FFPE skin samples of dogs and allow the identification of active infections by this parasite
Keywords in Portuguese
Leishmaniose Visceral CaninaHibridização in situ
Leishmania Infantum
PCR Quantitativa
DeCS
Leishmaniose VisceralHibridização In Situ
Leishmania infantum
Cães
Reação em Cadeia da Polimerase
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