Aplicação de novos métodos de controle de qualidade na fabricação da vacina BCG Moreau RDJ do Programa Nacional de Imunizações

Abstract

O agente etiológico da tuberculose é o M. tuberculosis, um patógeno intracelular, sendo uma das principais causadoras de mortes no mundo por um único agente infeccioso. A vacina BCG é constituída por uma cepa viva atenuada do M. bovis, amplamente utilizada para a prevenção da tuberculose (TB) e como agente imunoterápico contra o câncer superficial de bexiga. A Farmacopeia Brasileira e a OMS recomendam a técnica de contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) para a determinação da viabilidade, termoestabilidade e ensaios de potência da vacina BCG. Essa técnica é lenta, apresentando baixa reprodutibilidade e alta variabilidade nos resultados dos testes. A OMS tem realizado desde 1999, revisões dos requerimentos de qualidade da vacina BCG em uso visando a atualização das metodologias e padrões usados no controle. Dentre esses métodos encontra-se o ensaio de bioluminescência, ATP modificado, que pode ser utilizado para determinar o número de organismos viáveis nas vacinas liofilizadas e congeladas, incluindo novas cepas recombinantes. Outra recomendação para o controle de qualidade da vacina BCG baseia-se na confirmação da identidade do produto, nas características genéticas e morfológicas, na observação dos bacilos corados pelo método de Ziehl-Neelsen e na determinação das características das colônias crescidas em meio sólido. Estes métodos não permitem discriminar as diversas subcepas de BCG, assim como diferenciá-las de outros membros do complexo M. tuberculosis. O uso de técnicas empregando ácidos nucléicos foi introduzido como método alternativo de controle de qualidade para as subcepas de BCG na fabricação da vacina por ser específico, rápido, reprodutível, robusto e de baixo custo. O objeto do presente estudo, a atualização do controle de qualidade da vacina BCG Moreau RDJ, por meio da identificação genômica por PCR multiplex (PCRm) e avaliação da viabilidade por bioluminescência, de acordo com as novas normas preconizadas pela OMS possibilitou a avaliação de 10 lotes para determinar a relação de ATP pelo UFC. Nossos resultados indicaram que a quantidade de ATP produzido estava diretamente relacionada a quantidade de bacilos viáveis na cultura, mostrando uma correlação forte e positiva (r = 0,872961). A avaliação da identidade da vacina BCG Moreau RDJ foi realizada após uma padronização da extração do DNA genômico e amplificação por PCRm de cinco alvos genéticos e os resultados mostraram que a técnica é reprodutível e capaz de amplificar os fragmentos esperados RD2(315 pb), RD8(472 pb), senX3-regX3(276 pb), RD15(252 pb) e RD1(196 pb) em 9 dos 10 lotes testados, com a manutenção da identidade nos diferentes lotes. O presente trabalho faz parte de um estudo multicêntrico internacional coordenado pela OMS em andamento desde 2004, que visa à uniformização de novas metodologias de Controle de Qualidade cuja normatização deverá ocorrer após a análise dos resultados por comitês da OMS e, consequentemente, a melhoria das vacinas BCGs e de outras contra a TB, em desenvolvimento, que tenham como matriz micobactérias.