Molecular characterization of pseudomonas aeruginosa strains isolated from pharmaceutical industry facility by ERIC-PCR and MLST

Abstract

Pseudomonas aeruginosa é um microrganismo saprofítico que causa infecções humanas, principalmente infecções do trato respiratório. É um patógeno que pode sobreviver e formar biofilmes em superfícies de materiais inertes. Foi relatada resistência a múltiplos medicamentos deste patógeno, e a Organização Mundial da Saúde classificou-o como uma prioridade crítica devido à sua resistência aos carbapenêmicos. Na indústria farmacêutica, o isolamento de P. aeruginosa pode significar contaminação durante as etapas da cadeia produtiva. Neste cenário, técnicas de caracterização molecular, como a Reação em Cadeia da Polimerase-Consenso Intergênico Repetitivo Enterobacteriano (ERIC-PCR) e a Tipagem de Sequência Multi-Locus (MLST), permitem avaliar a diversidade genética e o perfil clonal dessas cepas, auxiliando a avaliação de desvios e análise de risco, tomando decisões sobre produtos imunobiológicos. O objetivo deste estudo foi tipificar cepas de P. aeruginosa (n=18) isoladas de uma instalação da indústria farmacêutica no período de 2015 a 2020 por meio de ERIC-PCR e MLST. O índice de Simpson (SI) foi aplicado para calcular o poder de resolução de ambas as técnicas de tipagem de cepas. As cepas foram isoladas a partir de testes de esterilidade de insumos farmacêuticos ativos (API, n=13), água purificada (PUW, n=3) e água potável (POW, n=2). O ERIC-PCR foi realizado utilizando o primer ERIC-2, e após a reação de amplificação, os padrões de bandas foram analisados utilizando o software BioNumerics 8.1, e o dendograma foi construído com o índice Dice e o Método de Grupo de Pares Não Ponderados com Média Aritmética. Para a determinação dos tipos de sequência (STs), os sete genes housekeeping foram amplificados de acordo com o PubMLST (//pubmlst.org/paeruginosa). Os produtos de PCR foram purificados e sequenciados pelo método Sanger. Os perfis MLST foram agrupados com o software BioNumerics 8.1 usando um coeficiente categórico e a representação gráfica foi avaliada usando a ferramenta de árvore geradora mínima e analisada usando o algoritmo eBURST para identificação de complexo clonal (CC) sendo uma variante de locus único (SLV) ou locus duplo variante (DLV). As 18 cepas formaram 17 perfis após ERIC-PCR e apresentaram 18 STs diferentes. Dez (50,0%) STs foram identificados no banco de dados: ST 17, 213, 308, 532, 640, 2.230, 2.287, 2.289,2865 e 2.963. Oito (40,0%) novos STs diferentes foram identificados como ST4292-4299. O MLST SI foi 1,00 e o ERIC-PCR SI foi 0,99 entre as cepas. O ST 640 já foi isolado de amostras de sangue e água na República Tcheca e na França e é um SLV do ST 1913. O ST 17 possuía 90 cepas depositadas, isoladas de diferentes fontes e água, em muitos países, formando um CC com 6.437 isolados, dividido em 2.398 STs diferentes. Os STs 17, 308 e 532 pertencem ao mesmo CC, com isolados de origem clínica e ambiental. Neste estudo, essas cepas foram isoladas de amostras de API. ST 4296 (isolado de PUW) é um SLV de ST 2230 (isolado de POW) que foi identificado em amostras clínicas (otite) nos EUA. Duas cepas apresentaram o mesmo cluster no ERIC PCR, mas STs diferentes (2289 e 4294) originados do API. Nenhuma cepa originária de uma instalação da indústria farmacêutica havia sido depositada no banco de dados do MLST até o presente estudo. Este estudo pode contribuir com a literatura científica no monitoramento de clones bacterianos e auxiliar outras indústrias farmacêuticas a erradicar cepas de P. aeruginosa em ensaios de controle de qualidade para imunobiológicos.