Expressão diferencial de Metalo proteases e cisteina proteases de Leishmania (Leishmania) infantum na infecção natural de cães

Abstract

Esta tese trata das proteases de Leishmania (Leishmania) infantum durante a infecção por esse parasito em cães. O estudo foi realizado com amostras biológicas de cães recolhidos pelo Centro de Controle de Zoonoses de Montes Claros (Minas Gerais/Brasil) após levantamento soroepidemiológico e de acordo com os regulamentos e diretrizes do programa de controle da leishmaniose. Na primeira fase deste estudo, uma coorte de cães (n = 33) foi classificada em assintomática (39,39%), oligossintomática (42,42%) e polissintomática (18,18%). Ensaios de imunoabsorção enzimática (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-ELISA) e de reação em cadeia da polimerase com gene espaçador transcrito interno (internal transcribed spacer 1- ITS1) foram realizadas em amostras dos três grupos de cães. Ambos os testes mostraram diferenças na confirmação da positividade: 87,88% por ELISA e 63,63% por ITS-1 PCR. A comparação dos testes mostrou: (i) positividade em ambos os testes (n = 57,57%), cães positivos para ELISA e cães negativos para ITS1-PCR (30,30%), cães positivos para ITS1-PCR e cães negativos no ELISA (6,06%) e negatividade em ambos os testes (6,06%). A positividade nos dois métodos (n = 19) mostrou sinais de caquexia (21,21%), lesões cutâneas (18,18%) e conjuntivite (12,12%) com maior prevalência. O sequenciamento de amplicons confirmou que todas as infecções foram causadas por L. (L.) infantum. Na segunda fase do estudo, passamos a investigar a expressão de protease na pele de alguns cães positivos para L. (L.) infantum (n = 20). A carga parasitária desses animais foi estimada a partir do kDNA-qPCR e variou de 0,10 ± 0,01 a 146,9 ± 2,65 ng/25 ng de DNA total. A análise de protease por reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) também foi avaliada, sugerindo mais transcritos de protease em amostras de cDNA de cães polissintomáticos do que em cães oligossintomáticos e assintomáticos. Os ensaios de metalo protease RT-PCR produziram produtos com alta largura de banda em todas as amostras de cDNA de cães avaliadas. Por outro lado, os transcritos da cisteína protease mostraram-se mais presentes e com maior intensidade de banda nas amostras de cDNA de cães polissintomáticos em comparação com amostras de cDNA de cães assintomáticos e oligossintomáticos. Esses achados são discutidos com base em ensaios preditivos in silico que sugeriram o potencial das estruturas secundárias dos mRNAs das metalo proteases serem mais estáveis do que as das proteases de cisteína, na temperatura da pele de cães. Na última etapa deste estudo, foi oportuno investigar a reatividade de soros de cães da mesma área endêmica contra uma proteína recombinante da região COOH terminal de 14 kDa da cisteína protease B (rcyspep). Foram avaliados soros de cães (n = 114), da área endêmica (n=80) sendo: cães suspeitos (n = 30) e positivos (n = 50) e de área não endêmica (n = 34). Os resultados indicaram que os soros dos grupos suspeito (42%) e positivo (68%) responderam de maneira diferente aos títulos de antígeno testados acima do ponto de corte (0,166). Coletivamente, os resultados deste trabalho reúnem evidências de que as metalo proteases e as cisteína proteases de L. (L.) infantum são expressas na leishmaniose visceral canina e podem atuar como fatores de virulência desse parasito.