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EVALUATION OF BIOLUMINESCENCE METHOD FOR STERILITY TEST OF BUFFER SOLUTION, BULK AND FINISHED PRODUCT OF A VIRAL VACCINE
Autor(es)
Afiliação
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos (Bio-Manguinhos). Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
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Resumo
O teste de esterilidade é uma das medidas destinadas a garantir a qualidade dos imunobiológicos, que devem ser estéreis, sendo adequados para revelar a presença de microorganismos. O teste de esterilidade deve ser realizado em uma amostra representativa com um tempo de incubação de 14 dias. Embora o ensaio seja eficiente, simples e de relativo baixo custo, apresenta algumas limitações como: resultados tardios, baixa seletividade do meio de cultura e variabilidade na resposta biológica dos microrganismos. Por outro lado, o método da bioluminescência é uma alternativa capaz de processar simultaneamente um grande número de amostras e obter resultados em menor tempo. O método consiste na extração de adenosina trifosfato (ATP) de células microbianas, utilizando o sistema enzimático luciferina/luciferase e medindo a luz gerada por um luminómetro. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da solução Phosphate Buffered Saline (PBS), do produto a granel e do produto acabado de uma vacina viral na análise realizada pelo sistema de bioluminescência (Celsis Accel® System - Charles River). Para o controle de cada produto, as amostras foram filtradas, de acordo com o método compendial, e incubadas durante 24 h a 32,5 °C com o meio fluido de tioglicolato e caldo de caseína-soja. Um frasco com o mesmo lote dos meios de cultura utilizados foi incubado nas mesmas condições e utilizado como calibrador. Para preparar os microrganismos, foi efetuada uma diluição de menos de 100 células de Staphylococcus aureus ATCC 6538, Clostridium sporogenes ATCC 11437 e Bacillus subtilis ATCC 6633 e incubada durante 24 horas a 32,5°C. Após o período de incubação, as amostras foram adicionadas em duplicata em cuvetes para análise no Celsis Accel® System, seguindo a ordem para cada meio de cultura: 1) 900 μl de Calibrador; 2) 900 μl de amostra controle; 3) Controle de ATP (900 μl calibrador + 100 μl ATP); 4) Amostra produto ATP (900 μl amostra controle + 100 μl ATP); 5) Amostra de produto microbiológico (900 μl de controle da amostra + 100 μl de Staphylococcus aureus, Clostridium sporogenes ou Bacillus subtilis) e 6) Controle microbiológico (900 μl de calibrador + 100 μl de Staphylococcus aureus, Clostridium sporogenes ou Bacillus subtilis). O sistema Celsis Accel® apresentou resultados adequados e viabilidade na análise do produto PBS. No entanto, para o produto a granel e o produto acabado, o sistema identificou a presença de ATP na amostra de controlo. Em conclusão, a utilização do sistema de bioluminescência na análise de vacinas virais, que são produzidas utilizando células, requer uma avaliação mais exacta e testes adicionais, incluindo a necessidade de avaliar a utilização de um maior volume de água de lavagem para remover resíduos de ATP da amostra que possam ficar retidos na membrana.
Resumo em Inglês
The sterility test is one of the measures designed to guarantee the quality of immunobiologicals, which must be sterile, being suitable for revealing the presence of microorganisms. The sterility test must be performed on a representative sample with an incubation time of 14 days. Although the assay is efficient, simple and with relative low cost, there is some limitations such as: late results, low selectivity of the culture medium and variability in microorganisms biological response. On the other hand, the bioluminescence method is an alternative capable of simultaneously processing a large number of samples and obtaining results in less time. The method consists of extracting adenosine triphosphate (ATP) from microbial cells, using the luciferin/luciferase enzymatic system and measuring the light generated by a luminometer. The aim of this study was to evaluate the effect of Phosphate Buffered Saline (PBS) solution, bulk and finished product of a viral vaccine in the analysis performed by the bioluminescence system (Celsis Accel® System – Charles River). For the control of each product, the samples were filtered, according to the compendial method, and incubated for 24 h at 32.5 °C with the fluid medium of thioglycolate and casein-soy broth. A flask of the same lot of the used culture media were incubated under the same conditions and used as calibrator. To prepare the microorganisms, a dilution of less than 100 cells of Staphylococcus aureus ATCC 6538, Clostridium sporogenes ATCC 11437 and Bacillus subtilis ATCC 6633 was made and incubated for 24 hours at 32.5°C. After the incubation period, the samples were added in duplicate in cuvettes for analysis on the Celsis Accel® System, following the order for each culture medium: 1) 900 μl of Calibrator; 2) 900 μl of Sample Control; 3) ATP Control (900 μl Calibrator + 100 μl ATP); 4) ATP Product Sample (900 μl Sample Control + 100 μl ATP); 5) Microbiological Product Sample (900 μl Sample Control + 100 μl of Staphylococcus aureus, Clostridium sporogenes or Bacillus subtilis) and 6) Microbiological Control (900 μl Calibrator + 100 μl of Staphylococcus aureus, Clostridium sporogenes or Bacillus subtilis). The Celsis Accel® system showed adequate results and feasibility in analyzing the PBS product. However, for bulk and finished product, the system identified the presence of ATP in the control sample. In conclusion, the use of the bioluminescence system in the analysis of viral vaccines, which are produced using cells, requires a more accurate evaluation and additional tests, including the need to evaluate the use of a larger volume of washing water to remove ATP residues from sample that may be retained in the membrane.
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