O papel da Tirosina Quinase SmFES na esquistossomose: estudos funcionais, avaliação da atividade de compostos e da regulação transcricional em Schistosoma mansoni

Abstract

A quinase SmFES participa de vias de transdução de sinais em Schistosoma mansoni envolvidas na transformação larval após a penetração nos hospedeiros. Em estudos anteriores do nosso grupo, a caracterização funcional de SmFES indicou seu papel na reprodução do parasito, na formação de granulomas hepáticos em modelo murino, e na atração do parasito por moléculas do muco do hospedeiro intermediário. Assim, este trabalho pretende avançar na caracterização funcional de SmFES e identificar compostos com potencial de interrupção do ciclo do parasito. Para isso, foi avaliada a longevidade de camundongos infectados com esquistossômulos expostos a Smfes-dsRNA. Esses animais apresentaram um aumento de 23% na taxa de mortalidade em relação ao controle inespecífico, infectados com esquistossômulos expostos a GFP-dsRNA. Ainda, o homogenato do fígado de camundongos infectados com esquistossômulos silenciados foi analisado quanto aos níveis de TNF-α, IFN-γ,IL-10, IL-6, MCP-1 e IL-12p70, apresentando redução de 72,3 e 46,3% na concentração de MCP-1 e IL-6, respectivamente. Também, lâminas confeccionadas a partir do fígado desses animais, foram analisadas quanto ao perfil de deposição de colágeno e composição celular, apresentando um perfil mais fibrótico e menos celularizado do que os grupos controle. Adicionalmente, para detecção do padrão de expressão de Smfes em diferentes estágios de S. mansoni, foi realizada a hibridização in situ com fluorescência em fêmeas adultas. Foram detectados transcritos de Smfes na região encefália/esofágica e em regiões reprodutivas, como o útero, ootipo e vitelária. Para a análise dos genes regulados por SmFES, foram geradas oito bibliotecas de RNAseq a partir do RNA de ovos de S. mansoni silenciados para Smfes. Todavia, em uma análise preliminar, algumas bibliotecas apresentaram perfis de expressão com alta variabilidade entre as réplicas. Também, um grande número de reads nas bibliotecas de ovos silenciados mapearam no gene de Smfes. Isso levou à detecção de superexpressão de Smfes na análise de expressão diferencial. Por fim, compostos preditos in silico como ligantes a SmFES e que demonstraram atividade anti-Schistosoma em outros estágios do parasito, foram avaliados em cultura de ovos para a verificação da eclosão de miracídios, atração e infectividade em Biomphalaria glabrata. O composto SmFES_17 apresentou redução de 8-12,9% na taxa de eclosão em comparação aos controles. Os miracídios eclodidos foram filmados antes e após a adição de muco de B. glabrata para avaliar a atração, sendo que os expostos aos compostos SmFES_9, SmFES_15, SmFES_18 e SmFES_22 exibiram menor atração pelo muco. Ainda, caramujos foram desafiados com miracídios eclodidos de ovos expostos aos quatro compostos que alteraram a atração pelo muco e a SmFES_17, que provocou alteração na eclosão. Após 40 dias, avaliou-se a liberação das cercarias, obtendo-se uma redução de 30,7 (SmFES_9) a 58% (SmFES_17) no total de cercarias liberadas. Em resumo, os resultados obtidos indicam que a redução da expressão de Smfes nos esquistossômulos, promove a alteração de fatores nos ovos liberados pelas fêmeas adultas que se desenvolvem, alterando o perfil de citocinas no fígado, afetando a densidade celular e a fibrose nos granulomas. Essa influência na resposta imune pode ser responsável pelo aumento da mortalidade em animais infectados com esquistossômulos silenciados. A localização de Smfes em órgãos reprodutivos de fêmeas de S. mansoni, sugere um papel no desenvolvimento e oviposição, enquanto sua localização na região encefaloesofágica pode ter implicações neurológicas. Os compostos avaliados reduziram a liberação de cercarias e/ou afetaram a eclosão de miracídios, apresentando alternativas promissoras para o desenvolvimento de novas estratégias de controle da esquistossomose.