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AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE WSOYA INFECTANDO SIMULIUM OYAPOCKENSE S.L. EM UM AMBIENTE NATURAL
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Abstract in Portuguese
A mansonelose é uma doença tropical negligenciada que está entre as causas mais comuns de parasitemia sanguínea no mundo. Na Amazônia brasileira, é causada principalmente pelo parasita Mansonella ozzardi, que é transmitido por uma das espécies de simulídeos mais vorazes do mundo: Simulium oyapockense. Infecções artificiais por Wolbachia em vetores filariais demonstraram ter um grande impacto na capacidade de transmissão do parasita filarial; no entanto, o impacto que a cepa wSoya Wolbachia está tendo na transmissão de M. ozzardi por S. oyapockense s.s. permanece quase completamente desconhecido. De fato, quase nada se sabe atualmente sobre a cepa wSoya e como ela interage com seu hospedeiro. Neste estudo, é relatado o desenvolvimento de um ensaio de PCR capaz de detectar o gene Wolbachia malekilling (WMK). Este ensaio foi usado para recuperar sete sequências WMK invariantes de sete S. oyapockense s.s. Simulídeos fêmeas selvagens capturadas e para mostrar sua presença em todos os espécimes positivos para Wolbachia (n=49) de S. oyapockense s.s. que foram testados. Este estudo também gerou perfis completos de tipagem de sequência multilocus (MLST) para sete espécimes de S. oyapockense s.s. dos quais sequências WMK foram recuperadas e confirmou que todos eles pertencem ao super clado B de Wolbachia. Isso foi alcançado usando um protocolo de PCR MLST otimizado que tem como alvo cinco genes de manutenção de Wolbachia: fabK; dnaA; ftsZ; coxA e wd0183. Seis dos perfis MLST foram idênticos, com o gene coxA sendo o único gene alvo de MLST no qual a variação foi detectada. Dois polimorfismos de nucleotídeo único foram identificados neste gene em um dos espécimes testados. Esta variação MLST detectada não pareceu, no entanto, correlacionar-se dentro da população S. oyapockense s.s. variação, já que três haplótipos de DNA mitocondrial foram encontrados em S. oyapockense s.s. com o mesmo perfil MLST e espécimes negativos para SNP com o mesmo haplótipo mitocondrial do espécime positivo também foram encontrados. Sequências do gene da proteína do capsídeo nuclear menor (MCP) WO também foram detectadas em todos os espécimes positivos para Wolbachia de S. oyapockense s.s. testados (n=49), mas não em espécimes negativos para Wolbachia que foram testados. As sequências de Sanger dos MCPs obtidos dos 7 espécimes com perfil MLST não detectaram variação entre os espécimes positivos para wSoya investigados, mas também mostraram que essas sequências de MCP são distintas de todas as sequências WO encontradas no GenBank. Em conclusão, portanto, os resultados deste estudo sugerem que wSoya é muito geneticamente homogêneo e se espalha e é mantido em altos níveis de prevalência por parasitismo male-killing. Os resultados também sugerem que o genoma wSoya contém uma nova família de WO que se espalhou recentemente pela população e pode, portanto, ser um alvo útil para o desenvolvimento de ferramentas de marcadores genéticos populacionais que podem ser usadas para rastrear a evolução desta cepa potencialmente importante epidemiologicamente de Wolbachia.
Abstract
Mansonellosis is a neglected tropical disease that is among the most common causes of blood parasitemia in the World. In the Brazilian Amazon it is caused mostly by the parasite Mansonella ozzardi, which is transmitted by one of the world´s most voracious simuliid species: Simulium oyapockense. Artificial Wolbachia infections in filarial vectors have been shown to have a major impact on filarial parasite transmission capacity; however, the impact that the wSoya Wolbachia stain is having on M. ozzardi transmission by S. oyapockense s.s. remains almost completely unknown. Indeed, almost nothing is presently known about the wSoya strain and how it interacts with its host. In this study, the development of a PCR assay capable of detecting the Wolbachia male-killing gene (WMK) gene is reported. This assay has been used to recover seven invariant WMK sequences from seven S. oyapockense s.s. wild caught female simuliids and to show its presence in all the Wolbachia positive specimens (n=49) of S. oyapockense s.s. that were tested. This study has also generated complete multi locus Sequence typing (MLST) profiles for seven S. oyapockense s.s. specimens that WMK sequences were recovered from and confirmed that they all to belong to the Wolbachia super clade B. This was achieved using an optimized MLST PCR protocol that targets five Wolbachia housekeeping genes: fabK; dnaA; ftsZ; coxA and WD0183. Six of the MLST profiles were identical with the coxA gene being the only MLST target-gene in which variation was detected. Two single nucleotide polymorphisms were identified in this gene in one of the tested specimens. This detected MLST variation did not, however, appear to correlate within population S. oyapockense s.s. variation, as three mitochondrial DNA haplotypes were found in S. oyapockense s.s. with the same MLST profile and SNP negative specimens with the same mitochondrial haplotype of the positive specimen were also found. WO minor nuclear capsid
protein (MCP) gene sequences were also detected in all of the tested (n=49) S. oyapockense s.s. Wolbachia positive specimens, but not in Wolbachia negative specimens that were tested. Sanger sequences of the MCPs obtained from the 7 MLST profiled specimens did not detect variation among the invesitated wSoya positive specimens, but also showed that these MCP sequences are distinct from all WO sequences found in GenBank. In conclusion, thus, the results from this study suggest that wSoya is very genetically homogonous and spread and maintained at high prevalence levels by male-killing reproductive parasitism. The results also suggests also that wSoya genome contains a novel family of WO that has recently spread through the population and may therefore be a useful target for the development of population genetic marker tools that can be used to track the evolution of this potentially epidemiologically important strain of Wolbachia.
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