Desenvolvimento e caracterização de anticorpos monoclonais e resposta de neutrófilos humanos frente a proteínas e anticorpos contra o SARS-CoV-2

Abstract

Um novo coronavírus, o SARS-CoV-2, foi identificado como o agente etiológico da coronavirus disease (COVID-19). A COVID-19 foi de grande impacto e ameaça à saúde global. Inicialmente não haviam testes de diagnóstico, tratamento específico, nem vacinas disponíveis para permitir o controle e prevenção da doença. Na primeira parte deste estudo, foi desenvolvido um anticorpo monoclonal murino pela tecnologia de hibridoma com potencial aplicação em pesquisas científicas, diagnóstico e tratamento da COVID-19. Além disso, esta pesquisa também incluiu a caracterização desta molécula para determinação da capacidade de neutralização viral. No segundo capítulo, avaliamos e resposta de neutrófilos (PMNs) humanos frente à proteínas e anticorpo produzido contra o vírus SARS-CoV-2, visto que estas células foram reportadas na literatura como células cruciais na COVID-19 grave e óbito. Os componentes do SARS-CoV-2 responsáveis por isso ainda não estavam elucidados. Avaliamos in vitro como os PMNs respondem às proteínas S1 da cepa de Wuhan e à variante Omicron do SARS-CoV-2, aos anticorpos anti-S IgG1 e aos complexos imunes (CIs) formados por eles. Também avaliamos esta resposta junto ao vírus Influenza A, visto que casos dessa coinfecção foram registrados em diversos países. Nossos resultados demonstraram que o anticorpo monoclonal produzido foi capaz de neutralizar a cepa selvagem do vírus bem como a variante Delta do SARS-CoV-2 no ensaio de microneutralização viral. Esta capacidade neutralizante não foi observada frente à variante Omicron. Nossos resultados mostram que quando estimulados, os PMNs respondem diferente à proteína S1 do vírus, anticorpo anti-S IgG1 e respectivos CIs. A proteína Wuhan S1 (W-S1) não afetou significativamente a geração de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) pelos PMNs enquanto Omicron S1 (O-S1) induziu significativamente essa geração. O anticorpo anti-S IgG1 induziu produção significativa de ERO pelo PMNs. Enquanto o complexo imune de Wuhan (W-IC) aumentou significativamente, isso não foi observado para Omicron (O-IC). A geração de ERO por PMNs humanos foram infectados com 1 MOI da cepa A/Hong Kong/8/1968 (H3N2) mostrou produção significativamente maior de ERO por PMNs do que células não estimuladas. Quando estimulados em conjunto (IAV e as moléculas descritas) não foi observada o aumento de ERO quando comparado com células não estimuladas. Na quantificação da enzima mieloperoxidase (MPO) por Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), observamos que a proteína W-S1, anti-S IgG1 e O-IC aumentaram significativamente a produção de MPO por PMNs em comparação com o controle negativo. A partir da quantificação de mediadores solúveis (citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento) por Luminex em sobrenadantes de PMNs, observamos diferenças entre a estimulação com cada molécula e os PMNs não estimulados. A partir do exposto, desenvolvemos uma molécula estável, de alta afinidade e funcional frente ao vírus SARS-CoV-2. Em conjunto, os resultados do capítulo II fornecem evidências científicas sobre a resposta de PMNs na COVID-19, sendo a reposta destas células variante-dependente. Palavras-chave: SARS-CoV-2; COVID-19; anticorpo monoclonal; anticorpos neutralizantes; neutrófilos; espécie reativa de oxigênio; mieloperoxidase; mediadores solúveis.