Please use this identifier to cite or link to this item:
https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/66248
Type
ThesisCopyright
Restricted access
Embargo date
2050-12-31
Collections
Metadata
Show full item record
DETECÇÃO DE SCHISTOSOMA MANSONI SAMBON, 1907 (TREMATODA: DIGENEA) POR METODOLOGIAS DE AMPLIFICAÇÃO ISOTÉRMICA (LAMP E RPA) EM AMOSTRAS DE HUMANOS E MOLUSCOS DO GÊNERO BIOMPHALARIA (PRESTON, 1910) (MOLLUSCA: GASTROPODA).
Schistosoma mansoni /parasitologia
Biomphalaria/patogenicidade
Mesquita, Silvia Gonçalves | Date Issued:
2022
Author
Advisor
Co-advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brazil.
Abstract in Portuguese
A Organização Mundial de Saúde lançou em 2022 um conjunto de seis recomendações para eliminação da esquistossomose como problema de saúde pública até 2030 e a detecção de S. mansoni em seus hospedeiros está contemplada em cinco delas. Métodos moleculares baseados em amplificação isotérmica de DNA são abordagens acuradas e que necessitam de poucos recursos e equipamentos, cujos resultados são fáceis de interpretar. Esta tese avaliou o desempenho de LAMP (amplificação isotérmica mediada por loop) e RPA (amplificação da polimerase recombinase) como alternativas para a detecção de S. mansoni em amostras de humanos e de moluscos provenientes de áreas de endêmicas para esquistossomose em Minas Gerais. Um ensaio de LAMP previamente descrito foi otimizado para garantir a especificidade da reação, enquanto um novo ensaio de RPA em tempo real foi desenvolvido. Os ensaios foram nomeados como: SmMITalt-LAMP (amostras humanas), SmMITmol-LAMP (amostras de moluscos) e SmMIT-RPA (ambas as amostras). Para avaliar as medidas de acurácia dos testes em amostras humanas, foi desenvolvido em paralelo a esta tese um modelo de classe latente que definiu os indivíduos verdadeiro-positivos. Para avaliar o desempenho de ambas as abordagens em amostras de moluscos, seus resultados foram comparados aos resultados de métodos baseados em PCR e sequenciamento de nucleotídeos. Todos os protocolos apresentaram 100% de especificidade analítica, com limites inferiores de detecção variando de 0,1 ng (SmMITmol-LAMP) a 1 fg (SmMIT-RPA). SmMITalt-LAMP em amostras de fezes apresentou sensibilidade de 72% e especificidade de 75%, enquanto em amostras de urina os valores estimados foram de 19% e 77%, respectivamente. SmMIT-RPA em amostras de fezes apresentou sensibilidade de 67% e especificidade de 99%. Em moluscos oriundos do campo observou-se a presença de S. mansoni em 33,3% dos pontos de coleta por SmMITmol-LAMP, enquanto por SmMIT-RPA a taxa de positividade foi de 55,5% dos locais, sendo, respectivamente, três e cinco vezes mais sensíveis que a técnica parasitológica tradicional. Os resultados deste estudo confirmam que LAMP e RPA são metodologias moleculares promissoras. Ambas geraram resultados satisfatórios em termos de sensibilidade analítica e especificidade quando utilizadas amostras de laboratório e de moluscos coletados em campo, entretanto, para utilização em amostras de humanos, SmMITalt-LAMP e SmMIT-RPA demandam futuras otimizações nas reações e/ou na fase pré-analítica de amostras.
Abstract
The World Health Organisation launched in 2022 a guideline composed of six recommendations aiming at the elimination of schistosomiasis as a public health problem by 2030. The detection of S. mansoni in its hosts is mentioned in five of the six recommendations, highlighting the relevance of the development and validation of novel methods more sensitive in endemic areas, and able to detect low-intensity and pre-patent infections. Molecular methods based on isothermal amplification are promising approaches due to their high accuracy, low-resource needs, and ease of results interpretation. Thus, this thesis assessed the performance of the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and recombinase polymerase amplification (RPA) as alternatives for the detection of S. mansoni in human and snail samples collected in areas of low endemicity in the state of Minas Gerais. A previously developed LAMP assay was optimised to ensure the specificity of the reaction, while a novel real-time RPA assay was developed. The assays are here on in termed as SmMITalt-LAMP (for human samples), SmMITmol-LAMP (for snail samples), and SmMIT-RPA (for both types of samples). To evaluate the accuracy of the tests performed on human samples, a latent class model was developed in parallel to this study from which the true-positive individuals were determined. To evaluate the performance of the tests performed on snail samples, the results obtained were compared to the results from PCR-based methods and DNA sequencing. All protocols were 100% specific to S. mansoni, with the limit of detection ranging from 0.1 ng (SmMITmol-LAMP) to 1 fg (SmMIT-RPA) and capable of detecting the parasite DNA in snails, stool and urine samples from laboratory. When clinical stool samples were used, SmMITalt-LAMP presented 72% sensitivity and 75% specificity, while in urine samples the assay presented estimated values of 19% and 77%, respectively. SmMIT-RPA on stool samples presented 67% sensitivity and 99% specificity. Infected snails were detected in 33.3% of the surveyed sites by the SmMITmol-LAMP and in 55.5% by SmMIT-RPA, representing a three- and five-fold increase of active transmission areas detected, in comparison to the parasitological examination. Results were considered satisfactory in terms of sensitivity and specificity when laboratory and field snails were used. Nevertheless, the use of clinical samples for S. mansoni diagnosis by SmMITalt-LAMP and SmMIT-RPA should be further optimised as well as the sample preparation and DNA extraction protocols.
DeCS
Esquistossomose mansoni/diagnósticoSchistosoma mansoni /parasitologia
Biomphalaria/patogenicidade
Share