Avaliação das atividades tripanocida e imunomodulatória de isolados de venenos de serpentes Crotalus durissus terrificus

Abstract

A doença de Chagas é uma das mais importantes doenças tropicais negligenciadas da atualidade, sendo causada pelo protozoário Trypanossoma cruzi. Apesar de acometer milhões de indivíduos, existem apenas dois medicamentos para seu tratamento, no qual apenas o Benzonidazol (Bz), é distribuído no Brasil. Nesse sentido, moléculas de origem animal, como as provenientes de venenos de serpentes, têm sido alvo de estudos por terem demonstrado potencial inibitório no crescimento de microrganismos. A peçonha da subespécie Crotalus durissus terrificus, é composta de ativos farmacológicos destacando a crotamina (CTM) e a crotoxina, que é composta de crotapotina e fosfolipase A2 (FLA2). O presente estudo objetivou avaliar as atividades anti-parasitárias, citotóxicas e imunomodulatórias da CTM e da FLA2. Para avaliar a citotoxicidade em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) humano, foi utilizado o método de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-di-fenil brometo de tetrazolina) em microplacas de 96 poços durante 24, 48 e 72 horas. A avaliação da atividade anti-parasitária dos isolados contra tripomastigotas de T. cruzi foi descrita pela primeira vez e consistiu da contagem de formas tripomastigotas sobreviventes em cada poço da microplaca de 96 poços tratados com diferentes concentrações dos isolados (100 a 0,02 μg/mL). Para avaliar a atividade imunomodulatória, seis citocinas (IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, IL-4, IL-2) foram investigadas a partir do sobrenadante de cultura de PBMC infectadas com formas tripomastigotas de T. cruzi, após tratamento com CTM e FLA, em microplacas de 96 poços durante 24 horas utilizando o kit CBA - Citometric Beads Array - para citometria de fluxo. Como resultados, a CTM não apresentou atividade anti-parasitária, contudo, embora ainda que não comprovada, esta molécula pode ser indutora de epimastigogênese nas concentrações de 100 a 25 μg/mL. Já a FLA2 apresentou uma dose letal promissora (DL50 = 11,61 μg/mL), sendo mais eficaz em altas concentrações (100 e 12,5 μg/mL). As duas moléculas não apresentaram citotoxicidade em PBMC, o que concorda com a literatura na qual várias linhagens celulares já foram estudadas. Quanto a imunomodulação, nas concentrações de 0,248 μg/mL e 11,61 μg/mL de CTM e FLA2, respectivamente, houve um aumento de IL-10 e IL-6 em decorrência da presença do parasita de modo estatisticamente significativo principalmente entre as condições T+CTM e CTM (p=0,0016; p= 0,0098, respectivamente) e T+FLA em relação ao tratamento feito apenas com FLA (p= 0,0029; p= 0,0132, respectivamente) e entre controles Bz e T+Bz nos testes com CTM (p= 0,0005; p= 0,0009) e FLA2 (p= 0,0004; p= 0,0037, respectivamente). A IL-2, por outro lado, teve os menores índices de produção, sendo detectada principalmente em condições livres do parasita e havendo diferença estatística apenas para CTM entre T+CTM e CTM (p= 0,0318). As citocinas IFN-γ e TNF não apresentaram diferenças estatísticas, embora tenha sido detectado níveis mais altos que as demais citocinas em poços com a presença de parasitas para ambos os isolados. De modo geral, FLA2 apresentou melhor desempenho em relação a CTM .