Caracterização de Leishmania infantum deficiente para a enzima Ascorbato Peroxidase endógena

Abstract

As leishmanioses são um conjunto de doenças infecciosas causadas por diferentes espécies do parasito do gênero Leishmania spp. que infectam milhares de pessoas por ano. O tratamento dessas enfermidades se mostra problemático, uma vez que os medicamentos são altamente tóxicos, de alto custo e já existem cepas do parasito que possuem resistência aos fármacos de uso clínico. Assim, é necessária a busca de novos alvos para a quimioterapia dessas doenças. A ascorbato peroxidase (APX) é uma enzima redox da via da tripanotiona que não está presente em humanos e que converte peróxido de hidrogênio em moléculas água, regulando o estresse oxidativo no parasito, evitando o dano celular. Estudos preliminares não obtiveram sucesso em deletar o gene APX em L. infantum. Sendo assim, esse estudo teve como objetivo superexpressar o gene APX de forma epissomal e deletar o gene APX endógeno para investigar seu papel nesse parasito. O gene APX de L. braziliensis foi expresso de forma epissomal em L. infantum e foi realizado o nocaute endógeno da APX pela metodologia CRISPR/Cas9. Resultados de PCR e qPCR mostraram a presença dos marcadores de resistência inseridos durante a transfecção, gerando clones de L. infantum que apresentam deleção da APX endógena e expressam APX epissomal (LiΔAPX + LbAPX). Mesmo após 20 passagens dos parasitos (LiΔAPX + LbAPX) em meio de cultura sem a pressão da blasticidina, que mantém o plasmídeo epissomal, não foi observada a perda do plasmídeo. A expressão do transcrito do gene APX avaliada por qPCR, mostrou que os clones mutantes de L. infantum (LiΔAPX + LbAPX) apresentaram uma redução na expressão do transcrito de 10 e 13 vezes quando comparados com os parasitos selvagem (LiWT) e superexpressor (LiWT + LbAPX), respectivamente. O clone de L. infantum superexpressor da APX epissomal foi mais resistente ao antimônio trivalente (SbIII) e à isoniazida, mas não apresentou diferença na tolerância ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e infectividade em macrófagos. Os parasitos L. infantum nocautes para APX endógena que expressam a APX epissomal (LiΔAPX + LbAPX) foram mais sensíveis ao SbIII e a isoniazida. Esses parasitos são mais susceptíveis ao estresse oxidativo gerado pelo H2O2 e apresentaram menor infectividade em células THP-1 que os parasitos selvagens. Esses resultados sugerem que a APX é uma enzima essencial para L. infantum sendo uma candidata importante para a busca de novos alvos para o tratamento das leishmanioses.