Avaliação da técnica “Loop-mediated isothermal amplification” (LAMP) para diagnóstico da leishmaniose visceral em cães provenientes de área endêmica do Rio de Janeiro, Brasil

Abstract

O diagnóstico de leishmaniose visceral canina (LVC) tem sido um problema para os serviços públicos de saúde, devido à variedade de sinais clínicos inespecíficos, e baixa sensibilidade e especificidade dos testes disponíveis. A leishmaniose visceral também acomete humanos, e o cão é o principal reservatório urbano desta doença grave. Diversos protocolos de testes moleculares, principalmente para a PCR, têm sido avaliados para LVC, mas estes encontramse restritos aos centros de referência. Um recente avanço no diagnóstico de diversas doenças infecciosas foi o desenvolvimento da técnica “loop-mediated isothermal amplification – LAMP”. O objetivo deste estudo foi comparar o desempenho dos ensaios LAMP e PCR convencional (cPCR) para diagnóstico da LVC, levando-se em consideração diferentes tipos de amostras clínicas (aspirados de medula óssea-MO e linfonodo poplíteo-AL, e swab de células de conjuntiva ocular), iniciadores (hsp70, kDNA e K26) e métodos de extração (kit comercial e método “Direct boil method”). Foram coletadas amostras clínicas de 54 cães, que apresentaram lesões cutâneas, alopecia, alterações de peso e oftálmicas e onicogrifose como principais sinais clínicos. Amostras foram submetidas às técnicas diagnósticas parasitológicas (exame direto, cultura e imuno-histoquímica), cPCR e LAMP, além de enzimas de restrição e eletroforese por isoenzimas para identificação das espécies. Destes, 79,2% (43/54) foram positivos em pelo menos um teste parasitológico. Dos 43, 36 foram confirmados para Leishmania infantum. Foi utilizado o teste parasitológico como padrão ouro para análise de sensibilidade (S) das técnicas moleculares. Após verificação do gene endógeno e Qubit os resultados de S da cPCR-kDNA foram 81,1%, 100%, 87,2%, 84,8% em AL, swab fervura (SW-DB), swab por kit (SW-kit) e MO respectivamente LAMP – alvo K26 apresentou resultados de S entre 62,2-86,5%, 96,7-100%, 59-76,9% e 84,8-97% para AL, SW-DB, SWkit e MO respectivamente em ensaios de LAMP 1 (ensaio 1), 2 (ensaio 2) e 3 (associação de ambos os ensaios). A S e especificidade (E) de AL com grupo controle de cães negativos foi de ScPCR: 81%, S-LAMP:62,2-86,5% e E-cPCR: 100% e E-LAMP:100%. Este estudo apresenta resultados inéditos para literatura cientifica, ao demonstrar o potencial da técnica de LAMP como método diagnóstico para LVC. O desenvolvimento e a avaliação de novos ensaios de LAMP-LVC direcionados para detecção de L. infantum, considerando a realidade nacional poderá tornar acessível um diagnóstico rápido, de simples realização e interpretação, com o potencial de uso por profissionais de laboratórios locais