Detecção e caracterização de Leishmania em espécimes clínicos por amplificação do gene HSP70 e análise dos perfis de restrição enzimática dos produtos amplificados

Abstract

Métodos bioquímicos e moleculares são utilizados como referência tanto para diagnóstico das leishmanioses quanto para a caracterização taxonômica dos parasitos encontrados. A partir do crescimento parasitário “in vitro” é possível realizar a caracterização espécie-específica de Leishmania pela técnica de eletroforese de isoenzimas, observando padrões específicos de acordo com cada espécie e, comparando com amostras de referência previamente conhecidas. Este trabalho teve como objetivo avaliar uma abordagem molecular baseada na amplificação de fragmento do gene HSP70 de Leishmania (HSP70 PCR) para detecção deste parasito em amostras clínicas de pacientes com Leishmaniose Tegumentar e para caracterização molecular do DNA amplificado. Consiste em um estudo transversal de avaliação da metodologia laboratorial, utilizando 104 amostras de fragmento cutâneo obtido por biópsia, oriundas de 90 pacientes, e coletadas para diferentes métodos diagnósticos (exame direto, avaliação histopatológica, cultivo “in vitro” e KDNA PCR), no período de 2005 a 2015. As amostras foram estratificadas em dois grupos: cultura positiva (n=50) e cultura negativa (n=54), onde, dentro do grupo de cultura positiva, foram selecionadas 25 amostras, randomicamente, para pareamento com culturas axênicas dos mesmos pacientes, que se encontravam armazenadas em nitrogênio líquido. A caracterização foi realizada através da técnica de polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição (HSP70 PCR-RFLP), com a utilização das enzimas de restrição BstUI e HaeIII, permitindo a discriminação de espécies do subgênero Viannia e Leishmania A HSP70 PCR foi realizada após quantificação do DNA genômico e seus resultados foram comparados com amostras de referência mantidas pelo Laboratório de Pesquisa Clínica e Vigilância em Leishmanioses e, com outras metodologias diagnósticas empregadas na rotina. O HSP70 PCR apresentou 50% de positividade nas amostras avaliadas e em relação às metodologias de rotina, o KDNA PCR (66%) apresentou melhor desempenho, seguido da histopatologia (39,42%) e do imprint (18,27%). O índice Kappa se mostrou mediano em comparação com o isolamento em cultura, indicou fraca concordância entre KDNA PCR e imprint, e nenhuma concordância com a histopatologia. As 25 amostras obtidas de culturas axênicas foram positivas ao HSP70 PCR, enquanto 64% das amostras de fragmento de pele dos mesmos pacientes foram positivas. Aproximadamente 90% das amostras positivas ao HSP70 PCR apresentaram perfil de Leishmania braziliensis, 5% de Leishmania guyanensis e 2% apresentaram, respectivamente, perfil de Leishmania amazonensis e Leishmania infantum. Todas as amostras caracterizadas por HSP70 PCR-RFLP obtiveram o mesmo resultado em comparação com a eletroforese de isoenzimas, mostrando assim ser uma alternativa diagnóstica para a caracterização taxonômica