Caracterização molecular e seleção de novas preparações antigênicas de Paracoccidioides americana para aplicação no diagnóstico laboratorial da paracoccidioidomicose

Abstract

A paracoccidioidomicose (PCM) é usualmente uma doença profissional associada ao trabalho agrícola, constituindo-se na micose sistêmica crônica mais importante no Brasil, com sequelas incapacitantes e redução da qualidade de vida dos indivíduos acometidos. A PCM pode ser causada por cinco espécies de Paracoccidioides, entretanto, Paracoccidioides brasiliensis sensu stricto e Paracoccidioides americana são endêmicas no estado do Rio de Janeiro. A morbimortalidade da PCM está associada ao diagnóstico tardio da doença, decorrente de vários fatores. O imunodiagnóstico, a partir de amostra de soro de casos suspeitos, viabiliza o diagnóstico específico da PCM de forma mais precoce, a fim de diminuir o desenvolvimento de sequelas e bem como da morbimortalidade a ela associada, além de ser fundamental para o acompanhamento terapêutico. Embora essa infecção seja estudada do ponto de vista clínico e laboratorial, os métodos de diagnóstico molecular têm sido pouco utilizados e ainda não amplamente avaliados. No presente estudo, nosso principal objetivo foi caracterizar molecularmente isolados de Paracoccidioides spp. e selecionar uma preparação antigênica de P. americana para o diagnóstico específico da PCM, para ser aplicada em laboratórios da rede pública do estado do Rio de Janeiro, através do estabelecimento de maior sensibilidade dos ensaios sorológicos de imunodifusão radial dupla (IDD) e Dot-Blot. Para isso, foi realizado o sequenciamento parcial dos genes arf e gp43. A variabilidade genética dos isolados caracterizados foi avaliada por PCR com primer M13. Os testes sorológicos de IDD, Dot-Blot e Western Blot (WB) foram realizados para seleção da preparação antigênica As amostras de soro utilizadas eram procedentes de pacientes diagnosticados rotineiramente no Laboratório de Micologia do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz (INI/Fiocruz). Neste estudo, foi possível determinar que P. brasiliensis sensu stricto e P. americana são as espécies causadoras de PCM no estado do Rio de Janeiro e, entre os isolados avaliados desta última espécie, não detectamos variabilidade genética intraespecífica. A forma clínica crônica (tipo adulto) foi predominante em pacientes com PCM causada por P. americana, que apresentaram idade superior a 50 anos e o clássico perfil laboral rural. O cell free antigen (CFA) de Pb03, isolado de referência de P. americana, obtido pelo método adaptado de Beraldo (2008) apresentou melhor desempenho nos testes de padronização e proporcionou maior sensibilidade ao ensaio de Dot-Blot (82,2%) que ao de IDD (46,7%). Esta preparação foi considerada estável pelo período de seis meses. Apesar da descrição de duas espécies causadoras de PCM no Rio de Janeiro, P. brasiliensis sensu stricto é majoritária nesta região. Sugerimos uma população clonal de P. americana no estado do Rio de Janeiro. O CFA de Pb03 selecionado neste estudo, pode ser utilizado para diagnosticar PCM através de ensaios de Dot-Blot