Avaliação de marcadores moleculares expressos nas formas promastigotas metacíclicas de Leishmania (Leishmania) infantum com o uso de modelo experimental in vivo de Lutzomyia longipalpis

Abstract

As fêmeas de flebotomíneos possuem posição central no ciclo de transmissão dos agentes etiológicos das leishmanioses, pois é no seu trato digestório que as Leishmania spp. assumem a forma infectiva metacíclica, em uma relação espécieespecífica entre parasito e inseto. Abordagens moleculares são eficazes para a detecção do DNA parasitário das diferentes formas evolutivas durante o seu desenvolvimento no vetor. Contudo, a presença de DNA não indica infecção ativa por Leishmania spp. no flebotomíneo e, portanto, não confirma a infecção natural. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi identificar genes como potenciais marcadores de formas metacíclicas de Leishmania (Leishmania) infantum ao longo da metaciclogênese no trato digestório de Lutzomyia longipalpis, buscando desenvolver uma metodologia auxiliar aos estudos de competência vetorial em flebotomíneos. Foi desenvolvido um ensaio de RT-qPCR para a avaliação de expressão gênica diferencial durante os estágios evolutivos de L. (L.) infantum nos modelos in vitro e in vivo, a partir de fêmeas de flebotomíneos de colônia infectadas experimentalmente e ensaiadas nos tempos pós-infecção (PI): 3 dias PI, 6 dias PI e 10 dias PI. Para isso, foi avaliado um painel de 20 pares de iniciadores, incluindo iniciadores para genes normalizadores (β-actina, α-tubulina, S8 e GAPDH) e genes expressos nos diferentes estágios (procíclica, nectomona, leptomona e metacíclica). Nos ensaios in vitro, seguindo a curva de crescimento, foram analisados diferentes métodos para o enriquecimento das formas metacíclicas, extração de RNA e as condições ideais da qPCR. O método por gradiente por Ficoll-540 e o uso de Trizol/clorofórmio foram selecionados. O ensaio de RT-qPCR revelou eficiência ótima dos iniciadores testados para o método ΔΔCt, na concentração de 10μM e anelamento à 56°C. Nos ensaios de expressão gênica in vitro, os genes HASPa1, Manosiltransferase, SCGR3, HASPb, SCGR5 e SHERP foram mais expressos pelas formas metacíclicas. Para os experimentos in vivo, os genes que mais se destacaram como potenciais marcadores de formas metacíclicas foram HASPa1, SCG4, Manosiltransferase e SCGR3, enquanto o alvo META1 foi mais expresso nas formas nectomonas. As perspectivas são de consolidar os resultados obtidos nas análises in vivo, com um maior número amostral, e analisar o potencial de aplicação desses alvos em insetos coletados em campo. Esperamos com este estudo produzir novos conhecimentos para melhor compreender quais espécies de flebotomíneos estão atuando como vetores em uma determinada região, e assim, auxiliar as estratégias de controle vetorial.