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2028-09-30
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POTENCIAL CATALÍTICO DE SERINA PROTEASES E CISTEÍNA PROTEASES DE LEISHMANIA SPP., VIA DEGRONS EM CITOCINAS E FATORES DE TRANSCRIÇÃO
Serina Proteases
Cisteína Proteases
Degrons
Citocinas
Fatores de Transcrição
Alternative title
Catalytic potential of serine proteases and cysteine proteases from Leishmania spp., via degrons in cytokines and transcriptions factorsAuthor
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Abstract in Portuguese
Esta tese trata de uma abordagem exploratória sobre ação catalítica de serina proteases e cisteína proteases de Leishmania spp., sobre citocinas e fatores de transcrição. Ao longo do trabalho é apresentado o mapeamento e caracterização de degrons em sequências de aminoácidos de citocinas e fatores de transcrição em Mus musculus. A primeira fase do estudo considerou buscas de degrons conhecidos em banco de dados que correspondem as serina proteases e cisteína proteases de Leishmania spp., baseado nos substratos de clivagem em comum para essas proteases. O mapeamento indicou degrons nas sequências estudadas: IFN-y, IL-5, IL-13 e IL-17 (n=15), e IL-4 (n=10), Nfkappa-B, STAT-1, CREB, BACH2 (n=15), e AP-1 (n=8), totalizando em 138 degrons mapeados. As menores ocorrências de degrons foram detectadas em AP-1 para prolil oligopeptidase e Oligopeptidase B, e em AP-1 e IL-4 para papaína. Na composição dos degrons é possível constatar que os aminoácidos arginina, fenilalanina, glicina e lisina, seguidos de isoleucina e histidina foram mais frequentes nos fatores de transcrição. Nas citocinas, os aminoácidos arginina, glicina, fenilalanina e leucina, seguidos de alanina e isoleucina foram mais frequentes. Os degrons encontrados ocorrem predominantemente em regiões de α-hélice das estruturas das citocinas e fatores de transcrição de M. musculus. Somente as proteínas BACH2, STAT-1 e IL-17 demostram degrons em regiões do tipo folha-β, e os degrons reconhecidos por papaína encontram-se principalmente em regiões de alça. O potencial dos degrons em conectar rede de interações in silico sugere que ações específicas de cisteína proteases e serina proteases do parasito podem interferir nos perfis de infecção Th1 e Th2. Ensaios in vitro com uma oligopeptidase B recombinante (rOPB) a partir do gene LAMA_000147800 de L. (L.) amazonensis também foram realizados. A expressão heteróloga da rOPB rendeu uma enzima ativa de ≈85 kDa, com característica típicas de OPB determinadas por ensaios de cinética de Michaelis-Menten e velocidade máxima na faixa de pH neutro, semelhantes a tripsina, com predomínio de folhas-β antiparalelas que se mantém estável até ≈50°C. Evidência de que a rOPB hidrolisa ligações peptídicas em IL-4 e IFN-γ como substratos proteicos são apresentadas. Este conjunto de resultados traz novos insights sobre a interação de Leishmania spp., com o hospedeiro vertebrado, ao considerar a ação de proteases sobre degrons em citocinas e fatores de transcrição.
Abstract
This thesis addresses an exploratory approach to the catalytic action of serine proteases and cysteine proteases from Leishmania spp. on cytokines and transcription factors. The mapping and characterization of degrons in the amino acid sequences of cytokines and transcription factors in Mus musculus are presented throughout the work. The first phase of the study involved searching databases for known degrons corresponding to serine proteases and cysteine proteases from Leishmania spp., based on the common cleavage substrates for these proteases. Mapping indicated degrons in the studied sequences: IFN-γ, IL-5, IL-13 and IL-17 (n=15), and IL-4 (n=10), Nfkappa-B, STAT-1, CREB, BACH2 (n=15), and AP-1 (n=8), totaling 138 mapped degrons. The lowest occurrences of degrons were detected in AP1 for prolyl oligopeptidase and Oligopeptidase B and in AP1 and IL-4 for papain. In the composition of the degrons, it is evident that the amino acids arginine, phenylalanine, glycine, and lysine, followed by isoleucine and histidine were more frequent in transcription factors. In cytokines, the amino acids arginine, glycine, phenylalanine, and leucine, followed by alanine and isoleucine were more frequent. The degrons found predominantly occur in α-helix regions of the structures of cytokines and transcription factors of M. musculus. Only the proteins BACH2, STAT-1, and IL-17 show degrons in β-sheet regions, and the degrons recognized by papain are mainly found in loop regions. The potential of degrons to connect interaction networks in silico suggests that specific actions of cysteine proteases and serine proteases from the parasite may interfere with Th1 and Th2 infection profiles. In vitro assays were also performed with a recombinant oligopeptidase B (rOPB) derived from the LAMA_000147800 gene of L. (L.) amazonensis. The heterologous expression of rOPB yielded an active enzyme of ≈85 kDa, with typical characteristics of OPB determined by Michaelis-Menten kinetic assays and maximum velocity in the neutral pH range, similar to trypsin, with a predominance of antiparallel β-sheets that remain stable up to ≈50°C. Evidence is presented that rOPB hydrolyzes peptide bonds in IL-4 and IFN-γ as protein substrates. This set of results provides new insights into the interaction of Leishmania spp., with the vertebrate host, considering the action of proteases on degrons in cytokines and transcription factors.
Keywords in Portuguese
LeishmaniaSerina Proteases
Cisteína Proteases
Degrons
Citocinas
Fatores de Transcrição
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