Avaliação de Mycobacterium smegmatis mc²155 como plataforma de expressão homóloga da enzima L-asparaginase

Abstract

O câncer é um grupo de doenças complexas com características semelhantes. A multiplicação desenfreada de células anormais e sua capacidade invasiva de tecidos adjacentes ou órgãos distantes do local de origem caracterizam esse grupo. A leucemia linfoide aguda (LLA) é um tipo de câncer que envolve a produção desordenada de células da linhagem linfoide e afeta, principalmente, a população infantil com idade entre 0 e 14 anos. O tratamento da LLA infantil envolve 3 fases: indução, consolidação e manutenção. Na primeira, a L-asparaginase é o principal medicamento utilizado para reduzir a taxa de células leucêmicas. A atividade antitumoral da L-asparaginase foi relatada em 1950, após observação da regressão de linfomas e melhora da sobrevida de camundongos. Este efeito ocorre porque as células leucêmicas podem ter baixa ou nenhuma expressão de asparagina sintetase e, consequentemente, uma dependência nutricional externa por L-asparagina. A Lasparaginase é capaz de depletar L-asparagina da corrente sanguínea de pacientes, causando restrição nutricional às células leucêmicas e induzindo a apoptose. Como as células saudáveis sintetizam a própria L-asparagina, elas não são afetadas pela depleção desse aminoácido. No entanto, as enzimas utilizadas no tratamento da LLA apresentam uma atividade secundária capaz de catalisar a degradação de Lglutamina. Estudos indicam que essa atividade secundária pode ser uma das principais responsáveis pelos efeitos colaterais causados durante o tratamento. De acordo com a literatura, a L-asparaginase de Mycobacterium tuberculosis possui maior atividade anti-tumoral que a enzima de Escherichia coli e atividade Lglutaminase não detectada. Dados prévios do nosso grupo indicam que o gene MSMEG_3173 presente em Mycobacterium smegmatis produziu uma enzima Lasparaginase recombinante funcional em E. coli, com atividade L-glutaminase não detectável. Neste trabalho, visamos avaliar M. smegmatis como uma nova plataforma de expressão homóloga de L-asparaginase utilizando o vetor pUS976. Para isso, utilizamos duas construções contendo o gene MSMEG_3173, uma contendo a sequência codificante para uma cauda de 6 histidinas, e outra sem. As construções realizadas foram confirmadas por PCR de colônia e sequenciamento de DNA. Os extratos proteicos referentes às frações intracelulares solúvel, insolúvel e extracelulares (secretadas) obtidos através de cultivo bacteriano por 48 horas em meio LB, à 37°C, sob agitação, foram analisados por SDS-PAGE 12% e WB. Por Western Blot (WB) utilizando anticorpos anti-6his e anti-L-asparaginase não houve detecção da proteína recombinante nos ensaios. Visando otimizar as condições de expressão, além dos cultivos em meio LB, também foram realizados cultivos em meio Sauton. A produção da proteína recombinante também foi investigada em condições de fase ativa de crescimento (48 h de cultivo) e durante o estágio de dormência (após de 15 dias de cultivo sob agitação, seguidos de 15 dias em repouso). Em nenhum desses ensaios foi possível detectar a produção da enzima Lasparaginase recombinante. A RT-PCR foi realizada para investigar a transcrição do gene MSMEG_3173. A transcrição do gene nativo de M. smegmatis mc²155 foi detectada, enquanto a transcrição dos genes a partir dos constructos não foi. Nossos resultados indicam que não foi possível produzir a enzima L-asparaginase recombinante nas condições testadas.