Perfil fenotípico de isolados clínicos de Leishmania (Viannia) braziliensis abordando comportamento in vitro, suscetibilidade ao antimônio, serina proteases e defesa oxidativa do parasito

Abstract

Leishmania (Viannia) braziliensis é o principal agente etiológico da Leishmaniose Tegumentar Americana, cujo tratamento de primeira escolha é o Glucantime®. Parasitos isolados de pacientes (n=12) que apresentaram cura clínica (Respondedores - R) e recaída ou falha terapêutica (Não respondedores - NR) foram selecionados e abordados por análises bioquímicas, moleculares, simulações in sílico e infecção in vitro para estudar heterogeneidade, plasticidade fenotípica e aptidão biológica. Inicialmente, a suscetibilidade in vitro ao antimônio trivalente (SbIII) e pentavalente (Sbᵛ) e atividade de serina proteases foram testadas. O SbIII distinguiu os amastigotas axênicos segundo o grupo R e NR enquanto a atividade enzimática foi independente do grupo clínico tendo diferentes taxas de inibição segundo o inibidor específico utilizado. Análise de componentes principais e agrupamento com esses dados discriminou um grupo homogêneo (NR) e três heterogêneos (R e NR). A expressão dos genes de subtilisinas (LbrM.13.0860; LbrM.28.2570) e TXNPx (LbrM.15.1080) foi diferencial sendo maior em 50% dos isolados entre os quais predominam os do grupo NR. Avaliamos também a capacidade de infecção dos isolados, influência sobre mediadores inflamatórios da resposta imune inata produzidos pelos macrófagos e expressão gênica de subtilisinas e oligopeptidase B (LbrM.9.0850). Os isolados mostraram duas tendências de infecção e a detecção de TNF-α, IL-6 e NO foi predominante no grupo NR. A expressão do gene LbrM.13.0860 foi significativamente maior em todas as formas intracelulares dos isolados, enquanto do LbrM.9.0850 em 59% deles. Nas formas promastigotas, o LbrM.13.0860 foi mais expresso em 25% dos isolados e o LbrM.9.0850 em 17% deles. Mediante análises in silico, avançamos na exploração da influência da temperatura na linearidade do mRNA e estabilidade do sítio catalítico das enzimas destes dois genes. Acima de 26°C, estruturas de hairpin sugerem uma região ativa de mRNA para ambos os genes, enquanto a 37°C uma estrutura do tipo pseudoknot no gene LbrM.13.0860. As estruturas 3D estão de acordo com a influência das temperaturas na estabilidade do sítio catalítico das enzimas codificadas pelos dois genes. A heterogeneidade descrita nas etapas anteriores foi evidenciada também pela presença do vírus de RNA de Leishmania 1 (LRV1) em isolados R (n = 1) e NR (n = 2). Diferentes respostas in vitro ao antimônio foram investigadas em dois isolados através da atividade da tripanotiona redutase (TR). Os resultados indicaram diferença estatisticamente significativa de atividade entre um isolado R versus um NR nas formas promastigotas, amastigotas axênicos e intracelulares. O conjunto de resultados apresentados neste trabalho de tese mostra a heterogeneidade dos isolados de L. (V.) braziliensis e sugere uma plasticidade fenotípica que pode influenciar a aptidão desses parasitos sob mudanças das condições experimentais.