Desenvolvimento de L-asparaginase humana para tratamento de leucemia linfoide aguda

Abstract

A L-asparaginase é uma enzima de relevância terapêutica para o tratamento da Leucemia Linfóide Aguda (LLA). As formulações comercialmente disponíveis apresentam limitações ao uso clínico principalmente devido às reações imunogênicas associadas à origem bacteriana dessas enzimas. Fontes alternativas desse medicamento, com maior compatibilidade biológica para o paciente e que apresentem propriedades similares ou melhoradas aos comercialmente disponíveis, são de interesse farmacológico. O domínio N-terminal da lisofosfolipase humana (hASNase1) possui atividade asparaginásica e apresenta potencial para reduzir problemas de imunogenicidade, embora essa enzima apresente baixa afinidade ao substrato L-asparagina. A proposta é otimizar a expressão proteica da hASNase1 em Escherichia coli (E. coli) e reproduzir a melhor condição para as enzimas variantes propostas por desenho racional, com o objetivo de obter mutantes que apresentem alta eficiência enzimática e baixa imunogenicidade quando comparadas às enzimas bacterianas. Ensaios das condições de expressão da hASNase1 em E. coli mostraram que a maior parte da proteína recombinante permaneceu na fração insolúvel do lisado bacteriano. Diferentes protocolos de solubilização dos corpúsculos de inclusão foram testados para recuperar a proteína recombinante, contudo esses não foram bem-sucedidos para redução da insolubilidade da hASNase1. Os corpos de inclusão foram solubilizados mediante o uso de ureia. Contudo, etapas de renaturação não foram eficazes para garantir a recuperação da atividade enzimática. A condição de cultivo em baixa temperatura (15 ºC) e baixa concentração de IPTG (0,25mM) foi padronizada para expressão da hASNase1 para obtenção de maiores concentrações de proteína na forma solúvel. Diferentes estratégias de purificação foram avaliadas para isolamento da hASNase1, porém, não obtivemos êxito na redução de alguns contaminantes, como proteínas constitutivas de choque térmico (“heat shock”). O uso de tampões com ATP 10 mM e asparagina 25 mM ajudaram a enfraquecer a interação entre GroEl (“heat shock”) e hASNase1, mas não foram efetivos para redução satisfatória de contaminantes ao final da cromatografia de afinidade. A expressão dos oito mutantes propostos por desenho racional seguiu a padronização da condição de expressão e separação proteica adotada para a hASNase1 selvagem. Os mutantes foram avaliados quanto à sua atividade catalítica e os resultados do ensaio de Nessler evidenciaram um aumento de atividade enzimática para todas as variantes, exceto o mutante 8, em comparação com a hASNase1. O mutante 4 se destacou dos demais por apresentar atividade 52 vezes maior que a enzima selvagem. O perfil de imunogenicidade dos mutantes avaliado por predições in silico indicou que não houve surgimento de novos epítopos. Análises de Dinâmica Molecular (DM) com o Mutante 4 mostraram que a permanência do substrato na região do sítio favoreceu a catálise quando comparado com a enzima selvagem. Os resultados foram satisfatórios e demonstraram que tal desenho experimental tem potencial para o desenvolvimento e obtenção de enzimas com atividade asparaginásica superior à hASNase1, apontando para o alcance de um substituto promissor às enzimas comercialmente disponíveis e com um potencial de menor imunogenicidade.