Desenvolvimento de um ensaio multiplex, baseado em microesferas carboxiladas, para o diagnóstico sorológico de leishmaniose visceral canina

Abstract

A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma infecção sistêmica, caracterizada por amplo espectro de manifestações clínicas. A infecção vem avançando para áreas urbanas, e o aumento do número de casos de cães com LV costuma ser correlacionado ao aumento subsequente de casos de LV em humanos, de forma que o cão se comporta como o reservatório doméstico. O protocolo diagnóstico da LVC, estabelecido pelo Ministério da Saúde brasileiro, utiliza o TR-DPP (do inglês, Dual Path Plataform) como triagem, seguido pelo ELISA, como teste confirmatório. Diversos estudos já demonstraram que esses testes apresentam falhas diagnósticas, principalmente na diferenciação de infecções ativas de convalescentes e de vacinados e em reações cruzadas com outras doenças comuns em cães, evidenciando a necessidade do desenvolvimento e aprimoramento de técnicas e seleção de novos antígenos para um diagnóstico sorológico sensível e acurado. No presente estudo foram avaliados, através da técnica de “Cytometric Bead Array” (CBA), três peptídeos derivados da proteína recombinante A2 (SV11, PP16 e VQ34) em duas diferentes composições, além da A2 recombinante e do antígeno total de promastigotas de Leishmania infantum (LiAg), frente a quatro grupos de cães com diferentes status sanitários: (a) negativos para LVC [LVC (-)], (b) negativos para LVC e vacinados com LeishTec® e cães positivos para LVC (LVC (+) [(c) sintomáticos e (d) assintomáticos]. Após a padronização das melhores concentrações de cada antígeno, melhor tampão para o acoplamento às beads e das titulações dos soros e do conjugado anti IgG canina para os ensaios, foram avaliadas as respostas dos grupos de cães para cada um dos antígenos, de maneira individual. Em relação ao LiAg, foi possível observar que os cães do grupo LVC (+) sintomáticos obtiveram 100% de resposta anti-LiAg, seguido pelo grupo LVC(+) assintomáticos com 80% e que nenhum animal dos grupos LVC (-) apresentou resposta positiva, demonstrando que o LiAg continua a ser um potencial marcador para animais infectados, mas ainda com limitações em relação a animais LVC (+) assintomáticos. Também foi possível constatar que, além do peso molecular, a TAG peptídica aqui utilizada foi fundamental para o sucesso do acoplamento. No caso do peptídeo VQ34 a utilização da TAG foi fundamental para otimizar o acoplamento às beads. Por outro lado, o acoplamento do peptídeo SV11 não obteve sucesso, mesmo com o uso da TAG. Os cães vacinados responderam para a proteína vacinal A2 e seus peptídeos derivados, destacando-se o VQ34 TAG. Em contrapartida, os cães LVC (+) sintomáticos e assintomáticos responderam para todos os antígenos aqui avaliados, porém com menor frequência e de forma mais heterogênea para a A2 e seus peptídeos. Na última etapa do estudo alguns soros foram avaliados em ensaios CBA multiplex, demonstrando que a técnica é funcional e sensível para o diagnóstico da LVC, mas que ainda são necessários ajustes para que a reação multiplex ocorra de forma otimizada.