Investigação dos linfócitos Treg produtores de TGF-β nas reações multibacilares e de parâmetros de exaustão linfocitária em pacientes lepromatosos da hanseníase

Abstract

A hanseníase é uma doença infecciosa crônica, negligenciada, típica de países tropicais. No Brasil, grande parte dos pacientes apresentam a forma multibacilar, que é a responsável pela disseminação do Mycobacterium leprae no ambiente. Essa classificação clínica apresenta reduzido controle bacilar devido a elevada hiporresponsividade imunológica ocasionada por linfócitos Th2, macrófagos M2 e pela imunidade humoral acentuada, que culminam na alta carga bacteriana, principalmente nos pacientes lepromatosos (LL). Entretanto, esses elementos imunológicos parecem não ser os únicos a contribuírem nessa supressão imunológica tão acentuada. Por isso, nosso trabalho teve como objetivo central a investigação da influência dos linfócitos T reguladores e linfócitos T expressando moléculas de exaustão na manutenção da resposta hiporresponsiva nos pacientes lepromatoso da hanseníase. Para isso, caracterizamos, por citometria de fluxo, as células Treg CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ e CD8⁺CD25⁺FOXP3⁺ ex vivo, bem como avaliamos a frequência dessas células produtoras de IL-10 e TGF-β in vitro. Além disso, quantificamos a concentração das citocinas produzidas no ensaio in vitro, por ELISA. Nessa primeiro bloco de resultados foram coletadas amostras de sangue periférico de 18 pacientes MB recém-diagnosticados e não tratados,19 pacientes MB com reações do Tipo I ou II e 15 voluntários sadios. Em relação a esse desenho experimental, nossos resultados mostraram que as TregCD4⁺ e CD8⁺TGF-β⁺ estão aumentadas nos pacientes MB e que a abertura dos processos reacionais provoca a depleção dessas células. Além disso, identificamos um perfil de citocinas mais pró-inflamatório nos pacientes com reação tipo I, com produção exacerbada de IL-17 e IL-6. Para o segundo bloco dos objetivos, recrutamos 46 pacientes LL, 60 pacientes paucibacilares (PB) e 36 voluntários sadios de área endêmica para a hanseníase. Posteriormente, avaliamos a expressão gênica de moléculas envolvidas com a exaustão celular de sangue periférico e fragmento lesão de pele por PCR, também identificamos neste último local a frequência de células CD3⁺PD-1⁺DAPI⁺ e CD3⁺LAG-3⁺DAPI⁺ por imunofluorescência, dosamos a concentração de PD-1 solúvel no plasma dos participantes da pesquisa por ELISA, avaliamos a frequência de células CD3⁺CD4⁺PD-1⁺, CD3⁺CD8⁺PD-1⁺ ex vivo, de sangue periférico, por citometria de fluxo, bem como as subpopulações de monócitos CD14⁺CD16⁺PD-L1⁺, CD14⁺CD16⁺PD-L2⁺, CD14⁺CD16ⁿᵉᵍPD-L1⁺, CD14⁺CD16ⁿᵉᵍPD-L2⁺, CD14ⁿᵉᵍCD16⁺PD-L1⁺, CD14ⁿᵉᵍCD16⁺PD-L2⁺. Por fim, mensuramos a frequência células mononucleares de sangue periférico produtoras de IFN-γ e de TNF após bloqueio de PD-1 com anticorpo monoclonal, também por citometria de fluxo. As análises revelaram que na pele dos pacientes LL havia maior expressão gênica de PD-1 e LAG-3, e de fato essas moléculas estavam sendo transcritas, visto que a imunofluorescência revelou maior frequência de células CD3⁺PD-1⁺DAPI⁺ e CD3⁺PD1⁺DAPI⁺ nesses indivíduos. No plasma, identificamos que os indivíduos LL possuem maior concentração de PD-1 solúvel, em comparação com os PB, e que essa métrica é inversamente proporcional à idade. Além disso, todas as subpopulações de linfócitos T PD-1⁺ estão aumentadas nos LL, assim como os diferentes tipos de monócitos PD-L1⁺ e PD-L2⁺. Por fim, observamos que o bloqueio de PD-1 foi capaz de aumentar a frequência de células produtoras de TNF e IFN-γ nos LL. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que os linfócitos T reguladores e a expressão parâmetros de exaustão parecem participar na manutenção do perfil hiporresponsivo dos pacientes MB e que bloqueio de PD-1 pode contribuir para o reestabelecimento da ação efetora linfocitária.