Estudo funcional e fenotípico acerca da aplicabilidade de modelos bi e tridimensionais de células cardíacas para identificação de novos candidatos á fármacos para doença de Chagas

Abstract

Estima-se que mais de seis milhões de indivíduos sejam afetados pela doença de Chagas (DC), cujo tratamento disponível é restrito a dois fármacos antigos, os nitroderivados Benznidazol (Bz) e Nifurtimox. Ambos têm eficácia limitada e desencadeiam efeitos colaterais, justificando a busca por novas terapias. Recentemente ensaios clínicos em pacientes crônicos, avaliando inibidores da biossíntese de ergosterol, o Posaconazol e o pró-fármaco do Ravuconazol (E1224) revelaram que ambos não foram capazes de sustentar o controle de carga parasitária, reforçando a importância de protocolos experimentais mais precisos para reduzir lacunas de tradução entre ensaios in vitro e in vivo e desfechos clínicos. No primeiro bloco, realizamos etapas de caracterização do sistema de cultivo 3D, investigando em esferóides cardíacos, toxicidade e eficácia do Bz frente à infecção experimental por Trypanosoma cruzi. Além disso, verificamos a liberação de mediadores infamatórios nos microtecidos. O Bz em esferóides cardíacos apresentou baixo perfil tóxico (LC₅₀> 200 μM) e além da análise molecular que confirmou sua a alta potência in vitro (EC₅₀ = 0.99 μM). Demonstramos por citometria de fluxo que houve aumento nos níveis de IL-6 e TNF-α (≈190 e ≈ 25 vezes) em esferóides parasitados em comparação com os não infectados. Bz a 10 μM foi capaz de suprimir a carga parasitária (92%) e reduzir concomitantemente a liberação de IL-6 (36%) e TNF-α (68%). Ademais, o estudo de rotas metabólicas, enzimas ou proteínas específicas ao parasito surgem como ferramenta importante na identificação de alternativas terapêuticas para DC. Neste cenário, dada a incapacidade do parasita de realizar a biossíntese de novo de purinas, no segundo bloco avaliamos atividade antiparasitária e toxicidade de análogos de nucleosídeos sob diferentes matrizes de cultura de células de mamíferos (2 e 3D), seguidas dos estudos de eficácia in vivo. Relatamos que nucleosídeos pirazolo[3,4-d]pirimidina exibem ação anti-T. cruzi, e que a inserção de um grupo 4-clorofenil no C-7 promoveu atividade antiparasitária (cp 44, EC₅₀= 0,32 μM) com elevado índice de seletividade (IS >197) sobre as formas intracelulares, sem induzir ação sobre formas sanguíneas até 81μM. Cp 44 apesar de suprimir a parasitemia e conferir sobrevida de camundongos Swiss Webster infectados por T. cruzi, não foi capaz de induzir cura parasitológica após imunossupressão. A seguir, foram sintetizados análogos do antibiótico tubercidina com diferentes substituições na posição C-7 e um deles o cp 14 (7-(4-clorofenil) resultou em atividade tripanossomicida (EC₅₀=0,85 µM, amastigotas da cepa Tulahuen) e seletividade (IS > 75). O cp 14 não foi cardiotóxico (LC₅₀> 200 μM) sobre modelos de cultivo 2D e 3D de cadiomioblastos H9C2, e manteve potência (EC₅₀ = 0.77 μM) contra formas intracelulares da cepa Y em monocamadas de H9C2. Sobre organóides infectados (cepa Y), cp14 teve semelhante efeito tripanossomicida que Bz, alcançando 78 e 87% de redução do parasitismo na concentração de 10 μM, respectivamente. Os dados promissores direcionaram estudos sobre modelo murino de infecção experimental por T. cruzi (25 mg/kg p.o. 2x dia por 5 dias). Cp14 suprimiu a parasitemia, entretanto foi incapaz de induzir esterilidade in vivo. A análise fenotípica dos análogos FH11706, FH10714 e FH8513 revelou potente atividade sobre formas intracelulares(EC₅₀: 0,2 – 1,1 μM) e sanguíneas (5,9 – 17,58 μM), além de IS>100. Os análogos a 10 μM reduziram > 90% do parasitismo em culturas H9C2 2D e 3D. Ensaios de washout mostraram que apenas FH10714 foi capaz de eliminar completamente os parasitas das culturas. A administração oral em animais sadios não revelou sinais tóxicos até 50 mg/kg e administração oral dos análogos (25 mg/kg, 1x/dia, 5 dias) nos modelos murino de infecção aguda suprimiu parasitemia em níveis comparáveis ao Bz, sem cura, porém o tratamento com FH11706, FH10714 resultou em índices de amplificação do DNA do parasita abaixo do limite de detecção (qPCR), diferentemente de Bz. O conjunto de dados demonstra promissora ação de análogos de nucleosídeos como candidatos a fármacos para doença de Chagas e que formas dormentes/persistentes assim como problemas de permeabilidade dos compostos possam contribuir para falhas na cura dos modelos experimentais estudados.