Vesículas extracelulares de tripomastigotas sanguíneos de Trypanosoma cruzi: caracterização morfológica, análise proteômica e ação na infecção de cardiomioblastos in vitro

Abstract

Vesículas extracelulares (EV) atuam como comunicadores celulares e moduladores da resposta imune, podendo ser empregadas como biomarcadores de doenças e sistemas de liberação de fármacos. Em doenças infecciosas, as EV podem ser liberadas pelo próprio patógeno ou pelas células hospedeiras (infectadas ou não infectadas), potencialmente impactando o resultado da resposta imune e processos patológicos. A doença de Chagas (CD), cujo agente etiológico é o protozoário Trypanosoma cruzi, é a principal causa de insuficiência cardíaca em áreas endêmicas. Durante a fase aguda de infecção, sinais e sintomas inespecíficos contribuem para a falha no diagnóstico e tratamento etiológico precoce. Nesta fase, o a resposta imune é crucial para o controle do parasito. A persistência do patógeno, a resposta imune desregulada e os fatores teciduais intrínsecos podem contribuir para a patogênese da CD crônica. A maioria dos soropositivos permanece na forma crônica indeterminada, porém porcentagem considerável dos indivíduos desenvolvem manifestações cardíacas, digestivas ou cardiodigestivas. Neste trabalho testamos a hipótese de que EV originadas do parasito contribuem para a criação de um microambiente inflamatório enriquecido com citocinas e mediadores pró-inflamatórios, que desencadeariam mecanismos de lesão tecido-específicos que contribuem para a disfunção cardíaca. Análises por MEV, MET e NTA mostraram que tripomastigotas sanguíneos (bTrypo) liberam EV, que variam entre 160 e 180 nm, de forma contínua pelo corpo celular e região flagelar. A análise proteômica dessas EV mostrou que a maior parte das proteínas identificadas apresentam função de metabolismo energético, seguida de metabolismo de proteínas e estrutura flagelar/metabolismo de cálcio. A comparação das proteínas identificadas nas EV de bTrypo com estudos de outras formas evolutivas e cepas do parasito, e também EV liberadas por elas, mostra que metabolismo de proteínas é o grupo proteico compartilhado por todos, sugerindo ser este um grupo relevante para busca de novos alvos terapêuticos. Além disso, as EV de bTrypo apresentam, majoritariamente, proteínas imunogênicas, sugerindo que essas EV regular processos celulares e resposta imune por mecanismos a serem esclarecidos. A exposição de cardiomioblastos da linhagem H9C2 ao ambiente inflamatório (TNF/IFNγ) promoveu redução na viabilidade celular, sendo os cardiomiócitos expostos a retinol (maduros) mais suscetíveis a este efeito, contudo exposição às EV de bTrypo mostrou-se silenciosa aos aspectos analisados. A combinação de citocinas nestas células não modificou a expressão de fibronectina, entretanto, promoveu redução da área celular, sugestivo de atrofia. O tratamento de cardiomiócitos maduros com a combinação de citocinas e EV de bTrypo, mimetizando aspectos de condições in vivo, não alterou a mobilização de cálcio para o meio intracelular, nem o potencial de membrana mitocondrial, assim como não alterou as concentrações de óxido nítrico nos sobrenadantes de cultivo. A exposição das células a este microambiente (citocinas e EV de bTrypo) também não alterou o índice de infecção por bTrypo. Em conjunto, esses dados sugerem que as EV de bTrypo poderiam atuar de forma silenciosa nos cardiomiócitos, não alterando parâmetros que controlariam a infecção, favorecendo a persistência do parasito. A longo prazo, as EV poderiam sustentar a inflamação no tecido cardíaco, por conterem proteínas imunogênicas, e contribuir para a morte de cardiomiócitos, permitindo a evolução da forma indeterminada para a forma cardíaca ou agravamento desta.