Avaliação do efeito de peptídeos derivados da laminina na sobrevivência, migração, proliferação e fusão de células musculares: aplicação em terapia para distrofias musculares

Abstract

A distrofia muscular de duchenne (DMD) é uma doença ligada ao cromossomo X causada por mutações no gene da distrofina. Essa proteína possui papel na estabilização do sarcolema durante a contração muscular, proporcionando a ligação mecânica entre os componentes contrateis e a matriz extracelular (MEC). Na sua ausência, há dano, inflamação e fibrose, levando à perda na função muscular. Progressivamente, os sintomas evoluem e o paciente chega ao óbito por volta da maioridade. Não há cura para DMD e a doença é letal, apesar das intervenções terapêuticas disponíveis, essas possuem efeitos colaterais consideráveis, portanto é necessária busca de novas terapias. A laminina-111 (LM-111) é uma glicoproteína cruciforme com três cadeias (α1β1γ1) derivada lâmina basal e possui efeitos relevantes no âmbito muscular. Sabe-se que proteínas da MEC, são suscetíveis à fragmentação, na qual ocorre a liberação de pequenos peptídeos biologicamente ativos. Diversos peptídeos derivados da LM-111 foram descritos, entre eles o AG73 derivado da porção globular da cadeia α1. O AG73 tem efeitos na angiogênese e neoplasias e também afeta células neurais e musculares. Nosso grupo descreveu efeitos desse peptídeo em células musculares de camundongos, onde promoveu migração, adesão e diferenciação. Portanto, no presente estudo, avaliamos o efeito do AG73 em células musculares humanas e como esses efeitos podem contribuir para propostas de terapias farmacológicas e celulares da DMD. Além disso, comparamos o efeito do AG73 versão murina com a sequência humana. Para a caracterização dos efeitos in vitro, utilizamos principalmente a célula CL48 (mioblastos humanos). No ensaio de adesão, as células aderiram à LM-111, ao AG73 (murino) e ao HuAG73, mas não à sequência embaralhada (scramble). A adesão celular à LM-111 depende de integrinas e proporciona uma morfologia espraiada. Os peptídeos aderiram mais via-sindecanos, deixando as células arredondadas. Na análise de proliferação em baixa concentração de soro, a LM-111 aumentou a proliferação a partir do terceiro dia e o HuAG73 a partir do quarto dia em comparação ao scramble. Para migração, utilizamos o ensaio de transwell e o HuAG73 foi capaz de reproduzir parcialmente o efeito da LM-111.Tanto a LM-111 quanto o HuAg73 aumentaram as taxas de migração (velocidade) de mioblastos e de fusão de mioblastos diferenciados. Considerando esses efeitos in vitro, no transplante de mioblastos, injetamos células primárias humanas (C25) pré-tratadas com LM-111, HuAg73 ou scramble como controle em camundongos imunodeficientes. A LM-111 aumentou a proliferação e fusão dessas células, já o HuAG73 aumentou a proliferação, fusão e dispersão dessas células no tecido transplantando. Para avaliar o efeito intramuscular, utilizamos camundongos mdx/DBA, modelo animal da DMD, e fizemos um tratamento preventivo ao pico de necrose. O tratamento com o HuAG73 aumentou a expressão de utrofina e a fosforilação de Akt nos músculos distróficos. Com o tratamento a longo prazo, o HuAg73 e o AG73 induziram mudanças no perfil de fibras musculares. Utilizando outra linhagem de camundongos mdx, o AG73 foi capaz de promover a regeneração no modelo de dano induzido. Em suma, o HuAG73 promoveu a adesão, a proliferação, migração e diferenciação de mioblastos. No músculo distrófico aumentou a fosforilação de Akt e a expressão de utrofina sendo um indicativo de melhora muscular. Portanto, o HuAG73 demostrou efeitos benéficos no âmbito muscular.