Otimização de metodologias para o estudo das funções das Lisina Demetilases (SmLSDs) de Schistosoma mansoni.

Abstract

A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada causada por trematódeos do gênero Schistosoma. Esse parasito tem ciclo de vida complexo passando por estágios de vida livre e parasitário, em dois hospedeiros: moluscos do gênero Biomphalaria e mamíferos, incluindo o ser humano. Para que sejam possíveis os diversos estágios do ciclo de vida além de suas adaptações aos habitats por eles ocupados, são orquestradas inúmeras regulações na expressão gênica, incluindo as mediadas por mecanismos epigenéticos. Dentre eles, a adição ou remoção de grupamentos nas caudas das histonas, realizadas por enzimas modificadoras de histonas, como os alvos desse trabalho, as Lisina Demetilases (SmLSD1, SmLSD2 e SmLSD3), responsáveis pela remoção de um ou dois grupamentos metil da lisina 4 da histona H3. Sendo assim, esse trabalho buscou a otimização de metodologias de silenciamento gênico por RNA de interferência, ChIP-seq e ATAC-seq para o estudo de função e da regulação promovida pelas SmLSDs. A partir de dados obtidos em trabalho realizado anteriormente, observou-se diminuição de tubérculos no tegumento de vermes adultos advindos de infecções de camundongos com esquistossômulos parcialmente silenciados para Smlsd1 e Smlsd2 de forma concomitante, sendo essas estruturas importantes na fixação dos parasitos nas veias do mesentério. Ademais, dados de RNAseq e RT-qPCR mostraram uma variação na expressão dessas enzimas entre os diferentes estágios do ciclo de vida do parasito, com Smlsd1 mais expressa em esquistossômulos e adultos fêmeas, Smlsd2 em cercarias e Smlsd3 em adultos machos e miracídios. Dados de scRNAseq e FISH evidenciaram expressão ubíqua dessas enzimas por todos os tipos celulares, sugerindo dinamicidade e complexidade dessa regulação e suas funções. Ainda, a detecção da expressão de Smlsd1 pela técnica de FISH também indicou uma expressão ubíqua em fêmeas adultas, com destaque para a região do ovário, apontando papel de SmLSD1 na ovoposição. Além disso, na tentativa de estabelecer um método de transfecção ideal para o silenciamento das Smlsds em esquistossômulos e vermes adultos, houve discrepância entre réplicas biológicas, indicando a necessidade de realização de mais experimentos. Contudo, foi possível observar aumento na área de esquistossômulos silenciados para as Smlsds, sugerindo seu papel nos tecidos do parasito, tal como o tegumento, e diminuição da postura de ovos de casais expostos ao dsRNA de Smlsd2, novamente, evidenciando a importância das SmLSDs no processo de ovoposição. Adicionalmente, os testes com três compostos com ligação predita para SmLSD1, mostraram potencial anti-Schistosoma do composto MC3384 para esquistossômulos e vermes adultos. As análises de abundância das marcas H3K4me1 e H3K4me2, tanto após exposição a dsRNA quanto ao composto, evidenciaram alteração nos padrões das metilações. Por fim, a padronização das técnicas de ChIP-seq e ATAC-seq mostraram promissores avanços para seu estabelecimento e utilização pelo grupo, permitindo em breve a investigação da função de cada Lisina Demetilase na regulação do epigenótipo e verificação da especificidade do composto ativo.