Trypanosoma cruzi expressando a proteína vermelha (tdTomato) para triagem de compostos ativos.

Abstract

A doença de Chagas, causada pelo protozoário parasito Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical negligenciada que afeta milhões de pessoas nas Américas, com altas taxas de morbidade e opções terapêuticas limitadas. Os únicos medicamentos disponíveis, benzonidazol e nifurtimox, têm baixa eficácia de cura, principalmente na fase crônica da doença, e efeitos adversos significativos, o que torna urgente a busca por novos compostos terapêuticos. Neste contexto, a otimização de novos modelos para a triagem de fármacos anti-T. cruzi é crucial. Os genes repórteres, como a proteína tdTomato, desempenham um papel importante em estudos para a triagem de compostos antiparasitários. A tdTomato é uma proteína fluorescente vermelha derivada do coral Discosoma e se destaca por sua alta fotoestabilidade e brilho intenso. Este trabalho teve como objetivo gerar e caracterizar clones das cepas Colombiana e Dm28c de T. cruzi que expressam o gene repórter tdTomato, a fim de validar seu uso como ferramenta eficiente na triagem de compostos anti-T. cruzi. A obtenção dos parasitos mutantes foi realizada utilizando os plasmídeos pTREX_BSD_tdTomato, que permite expressão epissomal, e pROCK_NEO_tdTomato, que quando linearizado integra-se por recombinação homóloga no genoma do parasito, no lócus da β-tubulina, conferindo expressão constitutiva. Resultados da caracterização do fitness desses mutantes mostrou que a expressão da proteína vermelha não alterou o crescimento das formas epimastigotas do parasito, morfologia, infectividade e capacidade de replicação intracelular em fibroblastos murinos. A fluorescência foi estável ao longo de passagens por seis semanas sem pressão seletiva do antibiótico de seleção. Essas linhagens mutantes foram submetidas a ensaios in vitro e in vivo para avaliar sua aplicabilidade na triagem de novos compostos anti-T. cruzi. Nos ensaios in vitro, a fluorescência permitiu o monitoramento em tempo real da resposta a diferentes concentrações de benzonidazol, sendo um modelo facilitador para a triagem rápida e eficaz de potenciais compostos terapêuticos. Nos ensaios in vivo, os mutantes fluorescentes foram testados em modelo murino, no qual foi possível visualizar a infecção através da fluorescência dos parasitos no coxim plantar e acompanhar a resposta ao tratamento com benzonidazol de forma precisa. Foi observada fluorescência nos parasitos recuperados dos órgãos baço e coração isolados dos animais 21 após a infecção. Os resultados obtidos sugerem que o modelo de triagem de compostos utilizando parasitos mutantes que expressam a proteína tdTomato é um grande avanço para estudos de triagem e validação de novos fármacos, oferecendo uma ferramenta inovadora com o gene integrado, que pode acelerar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas contra a doença de Chagas.