Desenvolvimento e validação do teste LeishID para detecção molecular de diferentes espécies de Leishmania por LAMP

Abstract

As leishmanioses compreendem um conjunto de doenças infecciosas que apresentam um desafio para a saúde pública. Podem ser classificadas em duas formas principais: leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT). Apesar da existência de várias abordagens no diagnóstico molecular disponíveis para detecção do DNA de Leishmania, a maioria se concentra somente na identificação do gênero e não oferece a distinção entre espécies. Estudos recentes identificaram espécies tradicionalmente associadas à forma cutânea da doença em pacientes com LV, bem como espécies que causam a forma visceral encontradas em lesões cutâneas. Além disso, o diagnóstico diferencial é essencial, uma vez que as manifestações clínicas da LT podem ser confundidas com a de outras doenças, como esporotricose, paracoccidioimicose e câncer de pele. Portanto, é urgente a necessidade de ferramentas de diagnóstico rápidas, sensíveis e específicas para auxiliar no controle da doença. A técnica de amplificação isotérmica de DNA mediada por alça (LAMP) se destaca por ser de fácil execução, rápida e altamente sensível. Nesse contexto, nós desenvolvemos e validamos internamente uma solução baseada em LAMP, chamada LeishID, que por meio do emprego de iniciadores espécie-específicos, é capaz de detectar o DNA de Leishmania concomitante à identificação das espécies que circulam no Brasil – L. infantum, L. braziliensis e L. amazonensis. Selecionamos alvos específicos de cada espécie a partir de 26 genomas de Leishmania disponíveis publicamente, abrangendo pelo menos 16 espécies diferentes. O genoma acessório foi filtrado para obter sequências únicas de cada espécie. Com o intuito de otimizar o tempo de reação bem como melhorar a sensibilidade e especificidade, associamos o produto de reação da LAMP a nanobastões de ouro, uma solução batizada de iAnG (isothermal amplification and nanogold). A depender dos iniciadores, 15 min de incubação já são suficientes para a detecção do DNA de Leishmania, embora 35 - 40 min garantam maior sensibilidade. O limite de detecção variou entre 0,01 fg a 1 pg. A utilização de conjuntos de iniciadores específicos possibilitou a detecção precisa das espécies analisadas, eliminando qualquer ocorrência de reação cruzada tanto entre elas quanto com o DNA de mamíferos. A validação clínica foi realizada utilizando biópsias de baço obtidas de cães diagnosticados com LV, biópsias de pacientes humanos diagnosticados com LT. A detecção colorimétrica demonstrou a capacidade de identificar L. infantum em amostras de cães com LV, apresentando uma sensibilidade de 98 % (IC: 88,7 - 99,9 %) e especificidade de 89 % (IC: 52 - 99,7 %). Para os casos de LT, o teste exibiu sensibilidade de 97,3 % (IC: 88 – 99 %) e especificidade de 100 % (IC: 60 – 100 %), na detecção de L. braziliensis. O teste também foi capaz de detectar L. infantum em amostras de DNA extraídas de flebotomíneos, com sensibilidade de 93 % (IC: 77 – 99 %) e especificidade de 97 % (IC: 84 - 99 %). A combinação da solução LeishID com o método de extração por fervura simplificado é compatível para amostras de tecido e revelou resultados promissores, destacando-se pela rapidez, alta especificidade e sensibilidade em concentrações clinicamente relevantes. A LAMP é compatível com testes point of care e pode ser aplicada para o monitoramento de cães tratados. Além disso, oferece uma valiosa alternativa para o diagnóstico diferencial das leishmanioses.