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Title: Diagnóstico molecular da infecção natural por Trypanosoma cruzi em triatomíneos nativos de área endêmica para doença de Chagas no estado do Ceará
Advisor: Costa, Filipe Anibal Carvalho
Pacheco, Raquel da Silva
Members of the board: Lima, Marli Maria
Mallet, Jacenir Reis dos Santos
Oliveira, Fernanda Santos de
Authors: Pinho, Irlane Faria de
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: A taxa de infecção por Trypanosoma cruzi em triatomíneos é um importante parâmetro para a avaliação do risco de transmissão vetorial da doença de Chagas em localidades onde há infestação doméstica e peridoméstica por estes insetos. A infecção por T. cruzi em insetos vetores costuma ser avaliada pelo exame, através de microscopia óptica, de suspensões do conteúdo intestinal fresco dos insetos, buscando-se nelas a presença de tripanossomatídeos flagelados. Esta metodologia apresenta como desvantagens a necessidade de se transportar os insetos vivos até o laboratório, além de não permitir a identificação da espécie de tripanossomatídeo presente nas fezes dos triatomíneos. Técnicas de biologia molecular baseadas na reação em cadeia da polimerase (PCR) têm, portanto, sido desenvolvidas para a identificação de T. cruzi em amostras biológicas, como o conteúdo intestinal dos triatomíneos. O objetivo desta dissertação foi avaliar a aplicabilidade e a sensibilidade de uma técnica de diagnóstico molecular da infecção natural por T. cruzi, baseada na utilização de papel de filtro, em triatomíneos capturados no estado do Ceará. Adicionalmente, procurou-se avaliar esta técnica diagnóstica em amostras do conteúdo intestinal de triatomíneos criopreservadas em papel de filtro durante 11 anos. Foram estudados os conteúdos intestinais de 68 espécimes de triatomíneos capturados no ano de 2000 (Rhodnius nasutus, n=40; Triatoma pseudomaculata, n=25 e T. brasiliensis, n=3), além de fezes de 51 espécimes coletados no ano de 2010 (T. pseudomaculata, n=15; T. brasiliensis, n=36). Os conteúdos intestinais obtidos por compressão abdominal dos 119 triatomíneos foram analisados pelo exame direto por microscopia óptica. As fezes foram diluídas sobre as lâminas de microscopia, em solução salina tamponada, cobertas com lamínulas e examinadas no microscópico óptico com aumento de 400 vezes, para observação direta da presença de tripanossomatídeos. Alíquotas das suspensões fecais foram separadas e aplicadas em tiras de papel de filtro (FTA Card, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), que foram armazenadas individualmente em tubos de 2 mL e acondicionadas em freezer a -20 ºC, para utilização na técnica de PCR, visando a detecção de kDNA de T. cruzi. Empregaram-se os iniciadores S35 5´- AAATAATGTACGGG(T/G)GAGATGCATGA-3`, e S36 5´- GGTTGCATTGGGTTGGTGTAATATA-3`, que amplificam o fragmento de 330 pares de bases contendo as regiões variáveis dos minicírculos do DNA do cinetoplasto (kDNA). O cálculo comparativo das sensibilidades das técnicas diagnósticas (microscopia óptica e PCR) foi realizado da seguinte forma: sensibilidade da técnica = número de exames positivos por esta técnica / número de exames positivos em quaisquer das duas técnicas. Com relação à análise dos 68 conteúdos intestinais criopreservados em papel FTA Card, 58 foram positivos pela microscopia óptica. Destes, 56 foram positivos pela PCR. Obteve-se, desta forma, uma sensibilidade comparativa de 96,5% para a PCR e 100% para a microscopia óptica. Analisando-se as 51 amostras fecais recém-obtidas de triatomíneos, obteve-se uma positividade, pela microscopia óptica, de quatro amostras e, pela PCR, de 14 amostras, obtendo-se uma sensibilidade de 100% para a PCR e de 28.6% para a microscopia óptica. A concordância entre as técnicas foi de 66/68 (97%) para as amostras criopreservadas e de 41/51 (80,4%) para as amostras recém-obtidas de insetos. Analisando-se as amostras em conjunto, obtivemos uma concordância de 107/119 (89,9%) entre as técnicas. O estudo conclui que a técnica de diagnóstico por PCR em amostras de conteúdo intestinal de triatomíneos aplicadas ao papel FTA Card é aplicável para a estimativa das taxas de infecção natural destes insetos pelo T. cruzi, sendo capaz de auxiliar a caracterização de perfis eco-epidemiológicos e a detecção da circulação do parasita em ambientes silvestres, peridomésticos e domésticos, contribuindo também para a avaliação do risco de transmissão da doença de Chagas em localidades onde há infestação pelos vetores.
Abstract: The rate of infection by Trypanosoma cruzi in triatomines is an important parameter for assessing the risk of vectorial transmission of Chagas disease in localities where domestic and peridomestic infestation by these insects are found. Infection with T. cruzi in triatomines is usually evaluated by examining, by light microscopy, suspensions of intestinal contents of fresh insects, seeking in them the presence of flagellate trypanosomatids. This approach has disadvantages as the need to transport the live insects to the laboratory, and not allow the identification of the trypanosomatid species present in the triatomine feces. Molecular biology techniques based on polymerase chain reaction (PCR) have therefore been developed to identify T. cruzi in biological samples, such as the intestinal contents of triatomines. The aim of this study was to evaluate the applicability and sensitivity of the technique of molecular diagnosis of natural infection by T. cruzi, based on the use of filter paper in triatomines captured in the Ceará state. Additionally, we sought to evaluate this diagnostic technique in samples of intestinal content of triatomines cryopreserved on filter paper for 11 years. We studied the intestinal contents of 68 specimens of insects captured in the year 2000 (Rhodnius nasutus, n = 40; T. pseudomaculata, n = 25 and T. brasiliensis, n = 3), and feces from 51 specimens collected in 2010 (T. pseudomaculata, n = 25; T. brasiliensis, n = 36). The intestinal content obtained by abdominal compression of 119 insects were analyzed by direct examination through optical microscopy. The feces were diluted on microscope slides in buffered saline (pH = 7.0), covered with coverslips and examined under optical microscope with 400 times magnification for direct observation of the trypanosomes presence. Aliquots of fecal suspensions were separated and applied to strips of filter paper (FTA Card, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), which were stored individually in 2 mL tubes and stored at -20 ° C for use in PCR , aimed at detection of kDNA of T. cruzi. The primers used were 5'-AAATAATGTACGGG S35 (T / G) GAGATGCATGA-3 'and 5'-GGTTGCATTGGGTTGGTGTAATATA S36-3', which amplify a fragment of 330 base pairs containing the hypervariable regions of the k-DNA minicircles. The comparative calculation of the sensitivity of diagnostic techniques (optical microscopy and PCR) was performed as follows: sensitivity = number of technical tests positive by this technique / number of positive tests in any of the two techniques. Regarding the analysis of 68 cryopreserved paper intestinal contents FTA Card, 58 were positive by light microscopy. Of these, 56 were positive by PCR. Was obtained in this way, a comparative sensitivity of 96.5% for PCR and 100% for light microscopy. Analyzing the newly obtained 51 fecal samples of insects, we obtained a positivity by light microscopy, four samples and PCR of 14 samples, yielding a sensitivity of 100% for PCR and 28.6% for optical microscopy. The agreement between the techniques was 66/68 (97%) for the cryopreserved samples and 41/51 (80.4%) for the newly obtained samples of insects. Analyzing the samples together, we achieved an agreement of 107/119 (89.9%) between the techniques. The study concludes that the technique of PCR for diagnosis in samples of intestinal content of triatomines applied to FTA paper Card is applicable for estimating natural infection rates of these insects by T. cruzi, is able to assist the characterization of eco-epidemiological profiles and the detection of the parasite in the wild environment, peridomestic and domestic, also contributing to the assessment of risk of transmission of Chagas disease in localities where there is infestation by vectors.
Keywords: Chagas Disease
Triatomine
FTA Card
PCR
Molecular diagnostic
Parasitologic diagnostic
keywords: Doença de Chagas
Triatomíneos
FTA Card
PCR
Diagnóstico molecular
Diagnóstico parasitológico
DeCS: Trypanosoma Cruzi
Insetos Vetores
Doença de Chagas/transmissão
Reação em Cadeia da Polimerase
Epidemiologia Experimental
Issue Date: 2012
Publisher: Instituto Oswaldo Cruz
Citation: PINHO, Irlane Faria de. Diagnóstico molecular da infecção natural por Trypanosoma cruzi em triatomíneos nativos de área endêmica para doença de Chagas no estado do Ceará.2012. 54 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Tropical) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, 2012.
Date of defense: 2012-04-09
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Medicina Tropical
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGMT - Dissertações de Mestrado

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