Alvos antigênicos baseados em proteína quimera aplicável a detecção de infecções do vírus Oropouche (OROV)

Abstract

As arboviroses são doenças negligenciadas que podem causar epidemias, e as mudanças ambientais, como o aquecimento global, facilitam a disseminação de vetores, bem como vírus Oropouche. Entre as principais arboviroses, se destacam a Dengue, Chikunguya e o Zika vírus. No Brasil, especialmente na Amazônia Ocidental, o vírus Oropouche (OROV) representa uma importante arbovirose devido a sua alta prevalência. Os sinais e sintomas se apresentam semelhantes às demais arboviroses, ocasionando possíveis subnotificações de casos. Logo, o diagnóstico diferencial é necessário para o correto perfil epidemiológico da Febre do Oropouche. Além disso é de fundamental importância acompanhar a evolução clínica, uma vez que essa doença pode desencadear sintomas hemorrágicos ou complicações neurológicas. Para isso, o presente estudo visa desenvolver e caracterizar uma proteína quimérica derivada da proteína do nucleocapsídeo (N) do vírus Oropouche, direcionada para a detecção de infecções causadas pelo OROV. Assim, foram selecionados peptídeos e construída uma proteína quimérica recombinante nomeada como OROV-NPqr. A análise linear permitiu identificar 9 epítopos, dos quais 3 foram selecionados com base nos maiores valores de score, disponibilizados no algoritmo Bepipred 2.0. A partir do alinhamento entre as sequências da proteína N do OROV e a proteína (N) do vírus Schmallenberg, com aproximadamente 70% de similaridade, foi realizada a análise estrutural. Na modelagem por homologia, foi possível a obtenção de proteínas conservadas em alça (loops) hélices-α e fitas-β. Também foi calculado o RMSD da sobreposição entre o Molde e o Alvo modelado (proteína N do vírus Oropouche) no USCF Chimera que resultou em 1,49Å. A padronização da expressão da proteína quimérica foi realizada em sistema microbiano utilizando as bactérias Escherichia coli cepas BL21(DE3) e SHuffle, em diferentes tempos de indução da expressão e concentrações de isopropil-β-D-thiogalactopiranosídeo (IPTG). A proteína quimérica foi purificada por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) e o perfil de expressão foi avaliado a partir eletroforese em gel SDS-PAGE. Ensaios de caracterização foram realizados a partir de testes imunoenzimáticos tipo ELISA e Westen Blot. Nas condições testadas na etapa de expressão, a proteína quimérica solúvel foi obtida a partir da cepa E.coli BL21(DE3) na concentração de 0,3 mM de IPTG, nas temperaturas de 15ºC e 20ºC, paralelamente a proteína insolúvel foi obtida à 37ºC. A presença da OROV-NPqr foi avaliada em eletroforese SDS-PAGE com a presença de proteína com peso molecular de aproximadamente 25 kDa. A caracterização da OROV-NPqr foi determinada por Western Blot, utilizando o anticorpo monoclonal anti-His-Tag com o reconhecimento do fragmento insolúvel com peso molecular compatível com a quimera. Por meio do teste imunoenzimático do tipo ELISA, foi possível detectar as concentrações de 0,5 μg e 1 μg da OROV NP-qr, pelo anticorpo anti-his-Tag. Como perspectiva serão realizados ensaios para avaliar a reatividade de anticorpos anti-OROV contra a quimera OROV-NPqr, com vistas à caracterização da proteína quanto a sua aplicação para a detecção diferencial da infecção provocada pelo vírus Oropouche.