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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/70072
EXPRESSION AND PURIFICATION OF ACTIVE SHIKIMATE DEHYDROGENASE FROM PLASMODIUM FALCIPARUM
Malaria
P. falciparum
Protein expression
Protein purification
Shikimate dehydrogenase
Author
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Rondônia. Laboratório de Bioinformática e Química Medicinal. Porto Velho, RO, Brasil / Fundação Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brasil / Centro Universitário São Lucas. Porto Velho, RO, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Rondônia. Laboratório de Bioinformática e Química Medicinal. Porto Velho, RO, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Rondônia. Laboratório de Bioinformática e Química Medicinal. Porto Velho, RO, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Centro Para el Desarrollo de la Investigación Científica. Asunción, Paraguay.
Centro Para el Desarrollo de la Investigación Científica. Asunción, Paraguay.
Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Rondônia. Laboratório de Engenharia de Anticorpos. Porto Velho, RO, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Brasília. Brasília, DF, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Rondônia. Laboratório de Engenharia de Anticorpos. Porto Velho, RO, Brasil / Fundação Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Rondônia. Laboratório de Bioinformática e Química Medicinal. Porto Velho, RO, Brasil / Fundação Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Rondônia. Laboratório de Bioinformática e Química Medicinal. Porto Velho, RO, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Rondônia. Laboratório de Bioinformática e Química Medicinal. Porto Velho, RO, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Centro Para el Desarrollo de la Investigación Científica. Asunción, Paraguay.
Centro Para el Desarrollo de la Investigación Científica. Asunción, Paraguay.
Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Rondônia. Laboratório de Engenharia de Anticorpos. Porto Velho, RO, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Brasília. Brasília, DF, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Rondônia. Laboratório de Engenharia de Anticorpos. Porto Velho, RO, Brasil / Fundação Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brasil.
Fundação Oswaldo Cruz. Fiocruz Rondônia. Laboratório de Bioinformática e Química Medicinal. Porto Velho, RO, Brasil / Fundação Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract
Plasmodium falciparum is known to cause severe malaria, current treatment consists in artemisinin-based combination therapy, but resistance can lead to treatment failure. Knowledge concerning P. falciparum essential proteins can be used for searching new antimalarials, among these a potential candidate is shikimate dehydrogenase (SDH), an enzyme part of the shikimate pathway which is responsible for producing endogenous aromatic amino acids. SDH from P. falciparum (PfSDH) is unexplored by the scientific community, therefore, this study aims to establish the first protocol for active PfSDH expression. Putative PfSDH nucleotide sequence was used to construct an optimized expression vector pET28a+PfSDH inserted in E. coli BL21(DE3). As a result, optimal expression conditions were acquired by varying IPTG and temperature through time. Western Blot analysis was applied to verify appropriate PfSDH expression, solubilization and purification started with lysis followed by two-steps IMAC purification. Enzyme activity was measured spectrophotometrically by NADPH oxidation, optimal PfSDH expression occur at 0.1 mM IPTG for 48 hours growing at 37 °C and shaking at 200 rpm, recombinant PfSDH obtained after purification was soluble, pure and its physiological catalysis was confirmed. Thus, this study describes the first protocol for heterologous expression of PfSDH in soluble and active form.
Keywords
Active enzymeMalaria
P. falciparum
Protein expression
Protein purification
Shikimate dehydrogenase
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