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Title: Caracterização molecular de Klebsiella pneumoniae multirresistentes produtoras de carbapenemase do tipo KPC isoladas em diferentes regiões do Brasil
Advisor: Asensi, Marise Dutra
Assef, Ana Paula D’Alincourt Carvalho
Members of the board: Moraes, Milton Ozório
Nauer, Simone Aranha
Marques, Elizabeth Andrade
Zahner, Viviane
Hofer, Ernesto
Authors: Pereira, Polyana Silva
Coordinator: Moraes, Milton Ozório
Lima, Leila Mendonça
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: Klebsiella pneumoniae é um patógeno Gram-negativo da família Enterobacteriaceae, frequentemente associado às infecções. Isolados clínicos de K. pneumoniae usualmente apresentam resistência a classe dos beta-lactâmicos, devido a produção de carbapenemase do tipo KPC. Além da resistência a todos os beta-lactâmicos disponíveis, a KPC possui alta capacidade de disseminação, pois tem sido descrita em plasmídios associados à transposons (Tn4401). Foi descrita inicialmente nos EUA, e atualmente se tornou uma ameaça global. A sua primeira descrição no Brasil ocorreu em 2006 e desde então sua incidência tem crescido significativamente. Assim, o objetivo desse trabalho foi analisar o polimorfismo genético, determinar o perfil de resistência a antimicrobianos, identificar o plasmídio carreador e a região flanqueadora do gene blaKPC de 165 amostras de K.pneumoniae produtoras de KPC provenientes de doze estados Brasileiros (AL, AM, CE, DF, ES, GO, MG, MA, PE, PI, RJ e SC) no período de 2006 a 2010. A confirmação da produção de KPC e identificação da variante alélica foram realizadas por PCR e sequenciamento. A susceptibilidade aos antimicrobianos foi determinada através de difusão em ágar (CLSI, 2011) e determinação da CIM por Etest® (ANVISA N°1/2010). PFGE e MLST foram utilizados para a análise epidemiológica. Avaliação da região flanqueadora do gene blaKPC foi realizada através de PCR para detecção do Tn4401. A identificação do plasmídio carreador do gene blaKPC foi realizada através de extração plasmidial (Kado e Liu, 1981) e hibridização (Sambrook e Russel, 2001). As amostras foram recuperadas principalmente a partir de sangue (39%) e urina (37%), e todas as cepas produziram KPC-2. Foi observada resistência a ciprofloxacina (95,7%), sulfametoxazol/trimetoprima (84,2%), amicacina (34%) e gentamicina (57%), fosfomicina (7,8%), polimixina B (11%) e tigeciclina (38%). A maioria das cepas se mostrou multirresistente, sendo três resistentes a todas as classes de antimicrobianos testadas. Através de PFGE, encontramos 28 grupos clonais, sendo três mais prevalentes: grupo A (40,6%- ES, RJ, SC e CE); grupo C (23% - CE, DF, MG, GO, PE e RJ); grupo Q (9,7%- AL, ES, DF e PI). Através de MLST, também se observou 28 clones, mostrando boa correlação. Os grupos clonais A/KpRj, C e Q foram designados por MLST como ST437, ST11 e ST340 respectivamente. Através de análise filogenética, observamos três complexos clonais entre nossas amostras: CC11 (ST11, ST340, ST437, ST757, ST855), CC16-17 e CC758-840. O CC11 apresenta grande importância epidemiológica, pois inclui dois STs que têm desempenhado papel de destaque em relação à disseminação do gene blaKPC: ST258 e ST11 (encontrado em nosso trabalho). O gene blaKPC-2 foi encontrado associado ao Tn4401, isoforma “a” em todas as amostras, e associado à plasmídios em 95,3% das amostras. Desses plasmídios, 92% eram de 40kb (IncN) e 8% de 55kb (IncL/M). Dessa forma, acreditamos que em nosso país esteja ocorrendo a disseminação do gene blaKPC tanto devido a dispersão de um mesmo plasmídio de aproximadamente 40kb do grupo de IncN entre cepas de diferentes STs, como também a disseminação de um mesmo complexo clonal (CC11), onde os clones A-KpRJ/ST437 e C/ST11 tem desempenhado importante.
Abstract: Klebsiella pneumoniae is a Gram-negative pathogen belonging to Enterobacteriaceae family, often associated with infections. Clinical isolates of K. pneumoniae usually show resistance to beta-lactams, due to production of KPC-type carbapenemase. In addition to resistance to all beta-lactams available, this carbapenamase has high capacity to spread, since it has been described in plasmids associated with transposons (Tn4401). KPC was first described in the U.S., and nowadays is considered a global threat. The first description of KPC in Brazil occurred in 2006 and since then its incidence has greatly increased. Thus, the objective of this study was to analyze the genetic polymorphism, determine the antimicrobial resistance profile, and identify the carrier plasmid and the flanking region of the blaKPC gene of 165 KPC-producing K.pneumoniae from twelve Brazilian states (AL, AM, CE, DF, ES, GO, MG, MA, PE, PI, RJ and SC) in the period of years 2006 to 2010. Confirmation of KPC production and identification of the allele variant were performed by PCR and sequencing. The antimicrobial susceptibility was determined by agar diffusion (CLSI, 2011) and MIC determination by Etest® (ANVISA 1/ 2010). PFGE and MLST were used for epidemiological analysis. Evaluation of flanking region surrounding the blaKPC gene was performed by PCR for the detection of Tn4401. The identification of the plasmid carrying the blaKPC gene was performed by plasmid extraction (Kado and Liu, 1981) and hybridization (Sambrook and Russell, 2001). The isolates were mainly recovered from blood (39%) and urine (37%), and all strains produced KPC-2. Resistance was observed to ciprofloxacin (95,7%), sulfamethoxazole/trimethoprim (84.2%), amikacin (34%), gentamicin (57%), fosfomycin (7.8%), polymyxin B (11%) and tigecycline (38%). Most of the strains showed multidrug resistant pattern, and three of them were resistant to all classes of antimicrobials tested. By PFGE, we found 28 clonal groups, three being the most prevalent: group A (40.6% - ES, RJ, SC and EC), group C (23% - CE, DF, MG, GO, RJ and EP); group Q (9.7% - AL, ES, DF and PI). By MLST, we also found 28 profiles, showing good consistency between these two methodologies. The clonal group A/KpRj, C and Q were designated by MLST as ST437, ST11 and ST340 respectively. Phylogenetic analysis showed three clonal complexes: CC11 (ST11, ST340, ST437, ST757, ST855), CC16-17 and CC758-840. The CC11 has great epidemiological importance, because it includes two STs that have been playing a prominent role in the spread of the blaKPC gene: ST258 and ST11 (found in our work). The blaKPC-2 gene was found associated with Tn4401, isoform "a" in all samples, and associated with plasmids in 95.3% of them. Of these plasmids, 92% had 40kb belonging to the IncN group and 8% had 55kb (IncL/M). Thus, we believe that our country is experiencing the spread of the gene blaKPC both associated with the dispersion of a single plasmid of approximately 40kb of the IncN group among strains of different STs, but also by the spread of the same clonal complex (CC11), where the clones A-KpRJ/ST437 and C/ST11 has played an important role.
keywords: KPC
DeCS: Klebsiella pneumoniae
beta-Lactamas
Carbapenêmicos
Tipagem de Sequências Multilocus
Issue Date: 2012
Publisher: Instituto Oswaldo Cruz
Citation: PEREIRA, Polyana Silva. Caracterização molecular de Klebsiella pneumoniae multirresistentes produtoras de carbapenemase do tipo KPC isoladas em diferentes regiões do Brasil. Rio de Janeiro, 2012. 132 f.: il. 30 cm. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular)- Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, 2012.
Date of defense: 2012-03-12
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Dissertações de Mestrado

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