Avaliação de metodologias moleculares para detecção e quantificação do vírus da Hepatite C

Abstract

O vírus da hepatite C (Hepatitis C Virus ou HCV) apresenta genoma constituído de RNA de fita simples, polaridade positiva, e pertence ao gênero Hepacivirus dentro da família Flaviviridae. O diagnóstico da infecção pelo HCV é feito por meio de testes sorológicos e moleculares. O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de metodologias para detecção e quantificação do RNA do HCV em dois grupos de pacientes: virgens de tratamento antiviral e durante o curso da infecção aguda. Amostras de soro obtidas de 43 indivíduos reativos para anti-HCV e de um grupo de seis indivíduos com amostras seriadas coletadas durante o curso da infecção foram submetidas às técnicas qualitativas (RT-nested PCR, PCR-ELISA e TMA) e quantitativas (PCR-ELISA Quantitativa e DNA ramificado ou bDNA) de detecção do RNA do HCV, e genotipagem por análise do polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism ou RFLP). A técnica TMA apresentou a maior taxa (98%) de detecção do RNA do HCV e a técnica bDNA apresentou a menor taxa (88%) de detecção do RNA viral. Ao compararmos os resultados obtidos entre as técnicas qualitativas (RT-nested PCR vs PCR-ELISA) e entre os testes quantitativos (PCR-ELISA Quantitativa vs bDNA) observamos boa concordância. Na PCR-ELISA Quantitativa (COBAS® AMPLICOR HCV Monitor Test v2.0) a não realização de diluição das amostras de soro com carga viral acima de 700.000 UI/mL pode ter subestimado os valores de carga viral. De acordo com a avaliação de minimização dos custos, os testes qualitativos de menor e maior custo foram RT-nested PCR e TMA, respectivamente, e os testes quantitativos de menor e maior custo foram COBAS® AMPLICOR HCV Monitor Test v2.0 e bDNA, respectivamente. O teste TMA foi o mais sensível dentre os três ensaios qualitativos analisados. Em relação ao desempenho dos testes quantitativos nas amostras seriadas, observamos que a carga viral foi melhor determinada pelo teste COBAS® AMPLICOR HCV Monitor Test v2.0, que apresentou valores de carga viral superiores aos do bDNA, chegando a apresentar diferença superior a dois logs em algumas amostras. Após avaliação da taxa de concordância das técnicas e de seus custos, foi proposto um algoritmo para detecção do RNA do HCV. Foi possível estabelecer que a RT-nested PCR utilizada no Laboratório de Hepatites Virais/ FIOCRUZ apresentou boa concordância com o teste qualitativo comercial PCR-ELISA, além de baixo custo quando comparado aos outros testes, mostrando assim a importância de sua validação futura.