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Title: Avaliação de metodologias moleculares para detecção e quantificação do vírus da Hepatite C
Advisor: Villar, Lívia Melo
Lampe, Elisabeth
Members of the board: Almeida, Adilson José de
Mendes, Leonardo Diniz
Paula, Vanessa Salete de
Favacho, Alexsandra Rodrigues de Mendonça
Santos, Flavia Barreto dos
Authors: Martins, Patrícia Pais
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: O vírus da hepatite C (Hepatitis C Virus ou HCV) apresenta genoma constituído de RNA de fita simples, polaridade positiva, e pertence ao gênero Hepacivirus dentro da família Flaviviridae. O diagnóstico da infecção pelo HCV é feito por meio de testes sorológicos e moleculares. O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de metodologias para detecção e quantificação do RNA do HCV em dois grupos de pacientes: virgens de tratamento antiviral e durante o curso da infecção aguda. Amostras de soro obtidas de 43 indivíduos reativos para anti-HCV e de um grupo de seis indivíduos com amostras seriadas coletadas durante o curso da infecção foram submetidas às técnicas qualitativas (RT-nested PCR, PCR-ELISA e TMA) e quantitativas (PCR-ELISA Quantitativa e DNA ramificado ou bDNA) de detecção do RNA do HCV, e genotipagem por análise do polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism ou RFLP). A técnica TMA apresentou a maior taxa (98%) de detecção do RNA do HCV e a técnica bDNA apresentou a menor taxa (88%) de detecção do RNA viral. Ao compararmos os resultados obtidos entre as técnicas qualitativas (RT-nested PCR vs PCR-ELISA) e entre os testes quantitativos (PCR-ELISA Quantitativa vs bDNA) observamos boa concordância. Na PCR-ELISA Quantitativa (COBAS® AMPLICOR HCV Monitor Test v2.0) a não realização de diluição das amostras de soro com carga viral acima de 700.000 UI/mL pode ter subestimado os valores de carga viral. De acordo com a avaliação de minimização dos custos, os testes qualitativos de menor e maior custo foram RT-nested PCR e TMA, respectivamente, e os testes quantitativos de menor e maior custo foram COBAS® AMPLICOR HCV Monitor Test v2.0 e bDNA, respectivamente. O teste TMA foi o mais sensível dentre os três ensaios qualitativos analisados. Em relação ao desempenho dos testes quantitativos nas amostras seriadas, observamos que a carga viral foi melhor determinada pelo teste COBAS® AMPLICOR HCV Monitor Test v2.0, que apresentou valores de carga viral superiores aos do bDNA, chegando a apresentar diferença superior a dois logs em algumas amostras. Após avaliação da taxa de concordância das técnicas e de seus custos, foi proposto um algoritmo para detecção do RNA do HCV. Foi possível estabelecer que a RT-nested PCR utilizada no Laboratório de Hepatites Virais/ FIOCRUZ apresentou boa concordância com o teste qualitativo comercial PCR-ELISA, além de baixo custo quando comparado aos outros testes, mostrando assim a importância de sua validação futura.
Abstract: Hepatitis C virus (HCV) has a positive polarity, single-stranded RNA genome, and belongs to the Hepacivirus genus within Flaviviridae family. The diagnosis of HCV infection is made by using serological and molecular tests. The aim of this study was to evaluate the performance of methods for detection and quantification of HCV RNA in antiviral therapy-naive patients and during the course of acute HCV infection. Serum samples obtained from 43 anti-HCV reactive individuals and a group of six individuals with serial samples collected during the course of acute infection were submitted to qualitative (RT-nested PCR, PCR-ELISA, and TMA) and quantitative (Quantitative PCR-ELISA and branched DNA or bDNA) techniques for detection of HCV RNA, and genotyping by Restriction Fragment Length Polymorphism analysis (RFLP). TMA test presented the higher rate (98%) of detection of HCV and bDNA test the lower viral RNA detection rate (88%). When we compared results obtained with qualitative (RT-nested PCR vs PCR-ELISA) and quantitative (Quantitative PCR-ELISA vs bDNA) techniques, a good agreement rate was observed. Performing Quantitative PCR-ELISA (COBAS® AMPLICOR HCV Monitor Test v2.0) with non-diluted serum samples with viral load greater than 700,000 IU/mL could have underestimated viral load values. According to minimum cost assessment, qualitative tests presenting the lowest and highest costs were RT-nested PCR and TMA, respectively, and quantitative tests with the lowest and highest costs were COBAS® AMPLICOR HCV Monitor Test v2.0 and bDNA, respectively. Among the three qualitative assays analyzed, TMA test was the most sensitive one. In relation to qualitative test’s performance in serial samples, we observed that viral load was better established by using COBAS® AMPLICOR HCV Monitor Test v2.0, which presented viral load values greater than those by bDNA, achieving difference above two logs in a few samples. After evaluating agreement rate among all techniques and its costs, an algorithm for detection of HCV RNA was proposed. It was possible to establish that RT-nested PCR used at Viral Hepatitis Laboratory/FIOCRUZ presented good agreement with the commercial qualitative PCR-ELISA, besides its low cost when compared to the other tests, thus showing the relevance of its future validation.
keywords: Amplificação mediada por transcrição
COBAS® AMPLICOR HCV Monitor Test v2.0
COBAS® AMPLICOR HCV Test v2.0
DeCS: Hepacivirus
Ensaio de Amplificação de Sinal de DNA Ramificado
Hepatite C
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
Issue Date: 2010
Publisher: Instituto Oswaldo Cruz
Citation: MARTINS, Patrícia Pais. Avaliação de metodologias moleculares para detecção e quantificação do vírus da Hepatite C. 2010. 93f. Dissertação (Mestrado em Medicina Tropical)- Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, 2010.
Date of defense: 2010-03-22
Place of defense: Rio de Janeiro/ RJ
Department: Pós-Graduação em Medicina Tropical
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programam de Pós-Graduação em Medicina Tropical
Copyright: restricted access
Appears in Collections:IOC - PGMT - Dissertações de Mestrado

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