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Title: Ribosome profiling: aplicação no estudo do processo de diferenciação de células-tronco obtidas de tecido adiposo humano
Advisor: Dallagiovanna, Bruno
Members of the board: Fragoso, Stênio
Faoro, Helisson
Duhagon, Maria Ana
Authors: Marcon, Bruna Hilzendeger
Coadvisor: Holetz, Fabíola Barbieri
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil
Abstract: As células-tronco (CTs) caracterizam-se por possuírem a capacidade de se autorrenovar e de dar origem a um ou mais tipos celulares diferenciados. Nos últimos anos, diversos trabalhos mostraram a existência de CTs em tecidos adultos, tornando-as uma alternativa interessante para uso em terapias celulares. Contudo, para melhor utilizar as CTs, é preciso primeiramente compreender como ocorre a diferenciação em um tipo celular específico e, principalmente, como é regulada a expressão gênica durante este processo. Em 2009, Ingolia e colaboradores apresentaram uma nova técnica conhecida como ribosome profiling, a qual consiste no isolamento e sequenciamento em larga escala dos fragmentos de RNA associados e protegidos pelos ribossomos, os quais têm um tamanho aproximado de 30 nucleotídeos (conhecido com footprint ribossomal). Ao mapear as sequências obtidas, é possível obter informações não apenas sobre quais sequências estão sendo traduzidas, mas também sobre a cinética da tradução e sua extensiva rede de regulação. Assim, o objetivo deste trabalho foi aplicar a técnica de ribosome profiling ao estudo do processo de diferenciação de CTs adultas. Como modelo de estudo, foram utilizadas CTs obtidas de tecido adiposo antes (t=0) e após a indução para diferenciação adipogênica por 3 dias (t=72h). O primeiro passo do trabalho foi a adaptação do protocolo de ribosome profiling para o estudo de CTs adultas, o qual consiste na lise celular, digestão do lisado com uma RNA nuclease (a qual irá degradar o RNA exposto, preservando os fragmentos protegidos pelo ribossomo), ultracentifrugação do homogenato sobre colchão de sacarose 1 M para sedimentação dos ribossomos, extração de RNA e isolamento dos fragmentos de 30 nucleotídeos. Também foi feita extração do RNA poliA. As amostras foram sequenciadas (SOLiD™) e os dados obtidos foram triados e mapeados contra um banco de dados de RNAm, utilizando-se a ferramenta CLC Genomics Workbench. Foram identificados mais de 8.000 transcritos para as amostras de ribosome profiling e mais de 17.000 para as de poliA. Ao calcular o fold change entre as condições t=0 e t=72h, foi possível verificar que mais de 50% dos genes foram detectados como diferencialmente expressos apenas por ribosome profiling. Observou-se que genes relacionados com vias de diferenciação adipogênica e de metabolismo de lipídeos encontravam-se regulados positivamente em ambas as amostras de RNA. Por outro lado, observou-se que vias de regulação do citoesqueleto de actina e de adesão focal estavam reguladas negativamente apenas nas amostras de ribosome profiling. Isso é interessante, uma vez que a inibição destas vias já foi descrita como importante para o processo de adipogênese. Além disso, foi observada uma forte redução na eficiência de tradução de genes relacionados com a tradução após 72 horas de indução para diferenciação. Os resultados obtidos no presente trabalho reforçam as evidências de que os mecanismos de regulação pós-transcricionais e traducionais têm um papel muito importante na regulação da diferenciação celular de CTs, sendo que a técnica de ribosome profiling permitiu obter informações mais detalhadas de como este processo pode estar acontecendo.
Abstract: Stem cells (SC) are characterized by their capacity of both self-renewing and giving rise to new differentiated cells. SC are found in adult tissues, which are considered a putative source for cell therapy. However, little is known about the mechanisms involved in the trigger of SCs differentiation into a specific cell type. Understanding adult SCs differentiation process is a fundamental step to better use and to take advantage of their potential. In 2009, Ingolia and collaborators presented a new methodology of transcriptome analysis named ribosome profiling, which consists on the isolation and deep-sequencing of the mRNA fragments enclosed by ribosomes. When lysed cells are submitted to nuclease digestion, unprotected mRNA is degraded, while fragments within ribosomes are preserved and have a known footprint of 30 nucleotides. Sequencing these ribosome-protected fragments results in a high-precision measurement of in vivo translation, providing precise information about translation kinetics and its extensive regulation. The objective of this work was to apply the ribosome profiling methodology to the study of adipogenic differentiation in adult SCs. SCs were isolated from human adipose tissue from three donors and were cultured in a control medium (t=0) and induced to adipogenic differentiation for 72 hours (t=72h). The first step was to adapt and optimize the ribosome profiling protocol to the SC model, which consists in cell lysis, cell lysate digestion by nuclease (to degrade unprotected RNA, preserving ribosome-protected fragments), ultracentrifugation over a 1M sucrose cushion to pellet ribosomes, RNA extraction and 30 nucleotides fragments isolation. poliA RNA was also isolated. Samples were submitted to deep-sequencing (SOLiD™) and the reads obtained were trimmed and mapped onto the reference mRNA database using the CLC Genomics Workbench. Over 8000 transcripts were identified in ribosome profiling samples and over 17000 in poliA samples. Fold change analysis between t=0 and t=72h of both RNA samples showed that differential expression of more than 50% of the genes was identified only by ribosome profiling. Pathways related to adipogenesis and lipid metabolism were upregulated in both RNA samples. However, regulation of the actin cytoskeleton and focal adhesion proteins were downregulated only in ribosome profiling samples. Interestingly, downregulation of these pathways was already described as an important phenomenon to cell adipogenesis. Besides, we observed a strong reduction of translational efficiency of genes involved in translation at t=72h. Our results reinforce previous data, suggesting that posttranscriptional and translational regulation play a fundamental role in the regulation of SC differentiation process and that ribosome profiling is an important tool to better understand this process.
Keywords: Adult stem cells
Differentiation
Ribosome profiling
Post-transcriptional regulation
keywords: Células-tronco adultas
Diferenciação
Ribosome profiling
Regulação pós-transcricional
Issue Date: 2014
Publisher: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Citation: MARCON, B. H. Ribosome profiling: aplicação no estudo do processo de diferenciação de células-tronco obtidas de tecido adiposo humano. 108 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Curitiba, 2014.
Date of defense: 2014-04-11
Place of defense: Curitiba/PR
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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