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Title: Antígeno NS1 dos Vírus Dengue desempenho de testes disponíveis comercialmente e aplicações alternativas para o diagnóstico precoce das infecções por dengue
Advisor: Santos, Flavia Barreto dos
Nogueira, Rita Maria Ribeiro
Members of the board: Fumian, Túlio Machado
Ferreira, Davis Fernandes
Montenegro, Fernanda
Azeredo, Elzinandes Leal de
Lemos, Elba Regina Sampaio de
Authors: Lima, Monique da Rocha Queiroz
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: A utilidade da proteína NS1 para o diagnóstico precoce e seu papel como uma ferramenta de diagnóstico adicional às abordagens existentes para a identificação das infecções por dengue já foi demonstrada. No ano de 2008, o Ministério da Saúde implantou unidades sentinelas em municípios estratégicos do país, utilizando testes de captura de antígeno (Ag) NS1 como um método de triagem e de diagnóstico precoce de casos suspeitos, contudo sem avaliações prévias. O presente estudo visou atender às demandas de avaliação e confirmação do papel destes testes na investigação de casos de dengue no país. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho e as aplicações alternativas dos testes de captura de NS1 disponíveis comercialmente. O desempenho dos testes Platelia NS1 ELISA (BioRad Laboratories) e pan-E Early ELISA, primeira geração (PanBio Diagnostics) e do teste rápido Ag Strip (BioRad Laboratories) disponíveis no mercado após a introdução destes no país, foi avaliado com um painel de 450 amostras. Dentre os três kits analisados, o teste NS1 Ag Strip foi o mais sensível (89%, 197/220), seguido pelo Platelia NS1 ELISA (84%, 184/220). O menos sensível foi pan-E Early ELISA com 72% (159/220) de sensibilidade. Uma menor sensibilidade foi observada em casos de DENV-3 por todos os três kits analisados A comparação de duas gerações do ELISA para a captura de NS1 do fabricante PanBio Diagnostics (pan-E Dengue Early ELISA e Early ELISA Dengue, segunda geração), após o aperfeiçoamento do teste pelo fabricante, demonstrou um aumento significativo na sensibilidade, de 72,3% (159/220) para 80% (176/220), p=0.05, respectivamente. As sensibilidades dos testes pan-E Dengue Early ELISA, Platelia NS1 ELISA e o NS1 Ag Strip utilizados como uma ferramenta alternativa para o diagnóstico de dengue em fragmentos de tecidos de casos fatais (n=23) foi de 34,7% (08/23), 60,8% (14/23) e 91,3% (21/23), respectivamente. Na análise de 74 fragmentos tecidos provenientes dos casos fatais, o teste NS1 Ag Strip apresentou uma sensibilidade significativamente maior (78,3%, 58/74 [p<0.05]). Este teste foi mais sensível na análise do fígado (91,3%; 21/23), pulmão (71,4%; 10/14), rim (100%, 4/4), cérebro (80%; 8/10), baço (66,6%, 10/15) e timo (100%, 3/3), quando comparado com os testes de ELISA avaliados. A utilidade dos testes de captura de NS1 também foi avaliada nas vigilâncias epidemiológica e entomológica após introdução do DENV-4 no Rio de Janeiro em 2011. Tanto o teste rápido NS1 Ag Strip quanto o Platelia NS1 ELISA confirmaram 4/9 (44,4%) dos casos suspeitos ocorridos na época e confirmaram a infecção em mosquitos Ae. aegypti coletados no campo. Relatos de uma baixa sensibilidade do teste de captura de NS1 no diagnóstico de casos de DENV-4, ocorridos após a introdução deste sorotipo no país, resultou na investigação de metodologias que visassem um aumento das sensibilidades obtidas Para tal, dois métodos de dissociação de imunocomplexos antígeno-anticorpo por calor e por dissociação ácida, foram testados. Foi observado um aumento significativo na sensibilidade do teste de 46,6% (217/466), quando as amostras não sofreram dissociação, para 70,4% (328/466) e 77,5% (361/466), p=0,017, quando sofreram dissociação ácida e térmica, respectivamente. Visando estabelecer a utilização de sangue coletado por punção digital em papel de filtro como espécime alternativo para a utilização em testes de captura de NS1, cinco protocolos, para a eluição do soro do papel de filtro foram avaliados. O protocolo descrito por Matheus et al. (2007), a utilização de 6mm de papel de filtro contendo a amostra e a eluição da amostra utilizando o próprio tampão do kit comercial, foi o protocolo mas sensível para a confirmação dos casos testados. Os resultados obtidos neste trabalho corroboram àqueles que demostram a utilidade da proteína NS1 no diagnóstico precoce das infecções por dengue e demonstram a aplicação alternativa na confirmação de casos fatais, detecção dos vírus em vetores e, potencialmente, sua utilização combinada com métodos menos invasivos de coleta de sangue
Abstract: The usefulness of the NS1 protein for early diagnosis of dengue infections and its role as an additional tool to existing diagnostic approaches has been demonstrated. In 2008, the Brazilian Ministry of Health established sentinel units in strategic cities of Brazil , using NS1 antigen (Ag) capture tests as a screening method and early diagnosis of suspected cases, however wit hout a previous evaluation. The present study aimed to meet the demands of evaluating and confirming the role of these tests in investigating dengue cases in the country. In this context, the goal of this study was to evaluate the performance and alternati ve applications of NS1 capture tests commercially available. The performance of the Platelia NS1 ELISA (BioRad Laboratories) and pan - E Early ELISA, first generation (PanBio Diagnostics) and rapid test NS1 Ag Strip (BioRad Laboratories) available in the mar ket after the introduction of these in the country, was evaluated with a panel of 450 samples. Among the three kits analyzed, the NS1 Ag Strip test was the most sensitive (89%, 197/220), followed by the Platelia NS1 ELISA (84%, 184/220). The least sensitiv e was the pan - E Early ELISA with 72% (159 /220) of sensitivity. A lower sensitivity was observed in DENV - 3 cases by all three kits analyzed. The comparison of two generations of the NS1 Ag capture ELISA from PanBio Diagnostics (pan - E Dengue Early ELISA an d Early ELISA Dengue, second generation) after a test improvement by the manufacturer, showed a significant increase in the sensitivity, from 72.3% (159 /220) to 80% (176/220), p=0.05, respectively. The sensitivity of the pan - E Dengue Early ELISA, Platelia NS1 ELISA and NS1 Ag Strip tests used as an alternative tool for the diagnosis of dengue in tissues of fatal cases (n=23), were 34.7% (08/23), 60.8% (14/23) and 91.3% (21/23), respectively. In the analysis of 74 tissues from dengue fatal cases, the NS1 Ag Strip test showed a significantly higher sensitivity (78.3%, 58/74 [p <0,05]) . This assay was more sensitive in the analysis of the liver (91.3%, 21/23), lung (71.4%, 10 /14), kidney (100%, 4/4), brain (80 %, 8/10), spleen (66.6%, 10 /15), and thymus (10 0%,3/3), when compared to the ELISA tests evaluated. The usefulness of the NS1 capture tests was also evaluated in the epidemiological and entomological surveillance after DENV - 4 introduction in Rio de Janeiro in 2011. Both the rapid test NS1 Ag Strip and the Platelia NS1 ELISA confirmed 4/9 (44.4%) of the suspected cases occurred at the time and confirmed the infection in Ae. aegypti collected in the field. Reports of a low sensitivity of the NS1 capture tests in diagnosing DENV - 4 cases occurred after the introduction of this serotype in the country and resulted in the investigation of methodologies to increase the sensitivities obtained. In that scenario, two methods for antigen - antibody immune complexes dissociation (heat and acid dissociations) were test ed. The sensitivity observed with the samples non - dissociated (46.6%; 217/466) was significantly improved when the samples were submitted to acid dissociation (70.4% ; 328/466) and heat dissociation (77.5 %; 361/466), p =0.017. To establish the use of fingers tick blood collection on filter paper specimens as an alternative specimen to use on NS1 tests, five protocols for eluting the serum from the filter paper were evaluated. The protocol described by Mat heus et al. (2007), using 6 mm of filter paper containin g the sample and the elution of the sample using the commercial kit buffer was itself, the most effective. The results of this study support those that demonstrate the usefulness of the NS1 protein in the early diagnosis of dengue infections and demonstrat e the alternative applications in confirming fatal cases, in the surveillance of the virus in the vectors and the potentially combined with less invasive methods of blood collection use.
DeCS: Dengue/diagnóstico
Proteínas não Estruturais Virais
Reação da cadeia pela polimerase
Testes Hematológicos/utilização
Issue Date: 2014
Citation: LIMA, M. da R. Q. Antígeno NS1 dos Vírus Dengue desempenho de testes disponíveis co-mercialmente e aplicações alternativas para o diagnóstico precoce das infecções por dengue. 2014. 198f. Tese (Doutorado em Medicina Tropical) – Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, 2014
Date of defense: 2014
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Medicina Tropical
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGMT - Teses de Doutorado

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