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Title: Expressão heteróloga de proteínas do vírus da Hepatite A e avaliação da imunogenicidade
Advisor: Medeiros, Marco Alberto
Galler, Ricardo
Members of the board: Leite, José Paulo Gagliardi
Paula, Vanessa Salete de
Ribeiro, Bergmann Morais
Santos, Regina Lopes dos
Araujo, Natalia Motta de
Authors: Silva Junior, Haroldo Cid da
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: O vírus da Hepatite A (HAV) é o principal agente etiológico das hepatites virais agudas e estima-se que ocasione 1,5 milhão de novas infecções no mundo anualmente. Apesar da eficácia apresentada pelas vacinas comerciais, a replicação do HAV em cultura de células é lenta e apresenta baixo rendimento, o que torna a sua produção difícil e dispendiosa. Nesse contexto, o uso de proteínas recombinantes do HAV pode representar uma alternativa ao modelo de vacina existente. O presente trabalho teve como objetivo expressar e avaliar a imunogenicidade das partículas virais destituídas de ácido nucleico (VLPs) e da proteína VP1 do HAV. As VLPs foram geradas a partir do sistema baculovírus/células de inseto através da infecção de células de inseto com baculovírus recombinantes contendo as regiões P1-2A e P3 do genoma do HAV. A poliproteína P1-2A foi expressa, clivada e se organizou em estruturas que continham epitopos conformacionais de neutralização. Partículas com características similares ao HAV foram identificadas por microscopia eletrônica, sugerindo que as proteínas expressas se montaram em VLPs. Em paralelo, a VP1 foi expressa nos sistemas baculovírus/células de inseto e Escherichia coli Níveis mais elevados de expressão foram obtidos em E. coli, o que consequentemente aumentou a taxa de recuperação da proteína purificada. A VP1 derivada de E. coli foi utilizada nos ensaios de antigenicidade e mostrou reatividade frente aos soros de pacientes infectados pelo HAV, o que demonstra seu potencial como um marcador para diagnóstico. Para os estudos de imunogenicidade, a VP1 derivada de E. coli foi combinada a dois adjuvantes, o hidróxido de alumínio (A1(OH)3) e o adjuvante a base de saponina. A formulação VP1+A1(OH)3 induziu polarização da resposta Th2, enquanto que a formulação VP1r+saponina gerou um balanço maior entre as respostas Th1 e Th2. O adjuvante saponina permitiu a administração de uma dose menor da VP1 sem afetar a intensidade da resposta. Resultados preliminares sugerem que os anticorpos anti-VP1 induzidos pela formulação com saponina apresentaram reatividade cruzada com o HAV. Além disso, testes iniciais indicam que os camundongos imunizados com a VP1 em associação com ambos os adjuvantes apresentaram resposta anamnéstica contra o HAV. Os resultados aqui apresentados sugerem que a VP1 e as VLPs podem ser úteis para o desenvolvimento de uma nova vacina contra a Hepatite A
Abstract: The hepatitis A virus (HAV) is the primary etiological agent of acute viral hepatitis and it is estimated to cause 1.5 million of new infections each year worldwide. Despite the effectiveness of commercial vaccines, the replication of HAV in cell culture is slow and has low yield, which makes it difficult and expensive to manufacture. In this context, the use of recombinant HAV proteins could represent an alternative model to the existing vaccines. This study aimed to express and evaluate the immunogenicity of virus-like-particles (VLPs) and VP1 protein of HAV. The VLPs were generated using the baculovirus/insect cell expression system by the infection of insect cells with recombinant baculovirus containing HAV P1-2A and P3 regions. The P1-2A polyprotein was successfully expressed, cleaved and organized into structures that contained neutralizing conformational epitopes. HAV-like particles were identified by electron microscopy, suggesting that the expressed proteins were assembled into VLPs. In parallel, VP1 was expressed in both baculovirus/insect cell and Escherichia coli expression systems. Higher protein levels were obtained in E. coli, which consequently increased the recovery rate after protein purification. The E. coli-derived VP1 was then used in antigenicity assays and showed reactivity against sera from patients infected with HAV, demonstrating its potential as a diagnostic marker. For immunogenicity studies, the E. coliderived VP1 was combined with two adjuvants, aluminum hydroxide (Al(OH)3) and the saponin-based adjuvant. The VP1+Al(OH)3 induced Th2 polarization, while VP1+saponin generated a Th1 and Th2 balanced immune response. Saponin-based adjuvant formulations allowed the administration of lower dose of VP1 without affecting the intensity of the response. Preliminary results suggest that the anti-VP1 antibodies induced by saponin-based adjuvant showed cross-reactivity with HAV. Furthermore, initial tests indicate that immunization of mice with VP1 in association with both adjuvants generated anamnestic response against HAV. The results presented here suggest that VP1 and VLPs might be useful to develop a new vaccine against hepatitis A.
keywords: Proteína VP1
DeCS: Vírus da Hepatite A
Baculoviridae
Escherichia coli
Imunogenética
Adjuvantes Imunológicos
Issue Date: 2015
Citation: SILVA JUNIOR, H. C. da Expressão heteróloga de proteínas do vírus da Hepatite A e avaliação da imunogenicidade. 2015. 165f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2015
Date of defense: 2015-Jul-09
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Embargo date: 2016-07-10
Copyright: restricted access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Teses de Doutorado

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