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Title: Avaliação do ELISA in-house e da Reação em Cadeia da Polimerase como ferramentas diagnósticas para Trypanosoma caninum em cães domésticos
Advisor: Madeira, Maria de Fátima
Toma, Helena Keiko
Members of the board: Marzochi, Mauro Célio de Almeida
Bastos, Otílio Machado Pereira
Confort, Eliame Mouta
Menezes, Rodrigo Caldas
Figueiredo, Fabiano Borges
Santos, Fernanda Nunes
Authors: Pinto, Andressa Guimarães de Souza
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Abstract: Trypanosoma caninum é uma espécie recentemente descrita em cães no Brasil. Ferramentas acuradas para o diagnóstico desse agente ainda não foram plenamente estabelecidas e a possibilidade de confusão com o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) tem sido uma preocupação. O objetivo deste estudo foi avaliar testes sorológicos (ELISA-Tc, EIE-LVC® e DPP®) e testes baseados na amplificação do DNA (PCR-18S rDNA e kDNA) e sequenciamento para investigação diagnóstica da infecção por T. caninum e Leishmania. chagasi em 229 cães. Os cães foram triados durante um senso sorológico para leishmaniose no Rio de Janeiro, Brasil, no ano de 2009, ocasião de coleta das amostras biológicas. A cultura parasitológica de fragmentos de pele foi empregada como padrão de referência e os resultados obtidos foram reunidos em dois artigos científicos. Dos 229 cães estudados, T. caninum foi isolado de 11 animais, exclusivamente na pele e L. chagasi de 12 animais, em sítios de pele e/ou lesão cutânea. No teste de ELISA-Tc, 39,3% (n=90) cães foram reatores, incluindo 8 dos 11 cães com isolamento de T. caninum e 11 dos 12 com isolamento de L. chagasi, conferindo ao ELISA-Tc índices de sensibilidade e especificidade de 71,72% e 62,39%, respectivamente. No teste DPP, 5,6% (n=13) cães foram reatores, incluindo 11 dos 12 cães com isolamento de L. chagasi, apresentando sensibilidade de 95% e especificidade de 99,08%. Já no EIE-LVC, 8,3% (n=19) cães foram reatores, incluindo todos os 12 cães com isolamento de L. chagasi. Esse teste apresentou 100% de sensibilidade e 96,77% de especificidade. Através da PCR-18S rDNA, 15,28% (n=35) cães foram positivos, dos quais 25 apresentaram padrão de amplificação similar à T. caninum e 10 padrão similar à L. chagasi. Esse resultado foi confirmado pelo sequenciamento Quando utilizamos a PCR-kDNA, detectamos 14 cães positivos (10 animais positivos pelo 18S rDNA, 12 com isolamento de L. chagasi e mais 2 animais que apresentaram resultados negativos na cultura e na PCR-18S rDNA). Nossos resultados mostraram que a cultura parasitológica não detectou todos os cães infectados por T. caninum e L. chagasi, considerando os dados sorológicos e moleculares aplicados neste estudo. Com relação aos testes sorológicos, verificamos que o ELISA-Tc apresentou acurácia moderada, diferente dos testes de DPP e EIE-LVC que apresentaram índices de sensibilidade e especificidade elevados. Um dado interessante foi verificar que não houve reatividade cruzada ao DPP e ao EIE-LVC dos cães parasitologicamente positivos para T. caninum. Os resultados da PCR, pelo 18S rDNA não tiveram concordância com os resultados sorológicos, demonstrando que o diagnóstico acurado da infecção por T. caninum não pode ser dado ainda, por uma única ferramenta. De um modo geral, nossos resultados mostraram mais uma vez que T. caninum e L. chagasi coexistem em cães no Rio de Janeiro; que o ELISA-Tc pode constituir uma ferramenta auxiliar para o diagnóstico de T. caninum e apontam a utilidade da PCR-18S rDNA para o rastreamento molecular, sobretudo em áreas de sobreposição com L. chagasi
Abstract: Recently, the parasite Trypanosoma caninum has been reported in dogs in Brazil. Techniques to accurately diagnose this infection are yet to be fully established, and therefore, the possibility of misdiagnosing canine visceral leishmaniasis (CVL) is a concern. The aim of this study was to evaluate various serological tests (ELISA-Tc, EIE-CVL®, and DPP®) as well as tests based on DNA amplification (PCR-18S rDNA and kDNA) and sequencing for diagnosis of infections caused by T. caninum and Leishmania chagasi in 229 dogs in Rio de Janeiro, Brazil. The dogs were screened during a serological survey for leishmaniasis and biological samples were collected. The skin culture was used as the reference control, and the results obtained were gathered in two scientific articles. Out of the 229 dogs studied, T. caninum was isolated only from the skin of 11 animals, while L. chagasi was isolated from the skin and/or skin lesions of 12 animals. On the basis of the ELISA-Tc test, 90 dogs (39.3%) tested positive. This included 8 of the 11 dogs infected by T. caninum species and 11 of the 12 dogs infected by L. chagasi strain, thereby displaying ELISA-Tc sensitivity and specificity indices of 71,72% and 62.39%, respectively. In the DPP test, 13 dogs (5.6%) tested positive, including 11 out of 12 dogs infected by L. chagasi species, showing a sensitivity and specificity of 95% and 99.8%, respectively. In the EIE-CVL test, 19 dogs (8.3%) tested positive, which included all 12 dogs infected by L. chagasi strain. This test showed a sensitivity and specificity of 100% and 96.77%, respectively. Thirty-five dogs (15.28%) tested positive in the PCR-18S rDNA analysis, out of which 25 showed an amplification pattern similar to T. caninum and 10 showed a pattern similar to L. chagasi. This result was confirmed by DNA sequencing When we used the PCR-kDNA technique, 14 dogs tested positive (10 dogs tested positive by 18S rDNA, 12 with the L. chagasi strain, and 2 more dogs whose culture and PCR results were negative). With regard to the serological and molecular data obtained from this study, we ascertained that the parasitological culture did not detect T. caninum and L. chagasi infection in all infected dogs. Among the serological tests, the ELISA-Tc showed moderate accuracy that was different from the DPP and EIE-CVL tests, which showed higher sensitivity and specificity indices. Interestingly, there was no cross-reactivity to DPP and EIE-CVL for the T. caninum-positive culture dogs. The 18S rDNA PCR results did not agree with the serological results, thereby proving that T. caninum infection cannot be accurately diagnosed using a single technique. Overall, our results proved that T. caninum and L. chagasi do coexist in dogs in Rio de Janeiro and that the ELISA-Tc test can be used as an adjunct for the diagnosis of T. caninum. These results also show the usefulness of PCR-18S rDNA for molecular screening especially in regions where to L. chagasi and T.caninum co-occur
DeCS: Trypanosoma
Cães
Diagnóstico
Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Leishmaniose Visceral
Issue Date: 2014
Citation: PINTO, A. G. de S. Avaliação do ELISA in-house e da Reação em Cadeia da Polimerase como ferramentas diagnósticas para Trypanosoma caninum em cães domésticos. 2014. 70f. Tese (Doutorado Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas) - Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, 2014
Date of defense: 2014
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas
Copyright: open access
Appears in Collections:INI - PCDI - Teses de Doutorado

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