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Title: Padronização e Otimização de Métodos Analíticos para o Controle de Qualidade da Eritropoetina Humana Recombinante
Advisor: L Homma, Akira
Guedes Júnior, Daniel da Silva
Authors: Medeiros, Ingrid Pinheiro de
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: A Eritropoetina é uma glicoproteína produzida pelo rim que atua como fator hormonal na formação de eritrócitos. A clonagem do gene da Eritropoetina Humana levou à produção da proteína recombinante (EPOhr) para o tratamento de anemias associadas à insuficiência renal crônica, uso terapêutico de Zidovudina, tratamentos oncológicos e redução de transfusões sanguíneas. O controle de qualidade de proteínas recombinantes requer a combinação de metodologias para a completa identificação, caracterização e avaliação da potência biológica. Dentre as metodologias preconizadas para análise da homogeneidade da EPOhr pela Farmacopéia Européia (F.E.) e pelo Centro de Inmunología Molecular (CIM), destaca-se a Focalização Isoelétrica (IEF), Eletroforese Capilar de Zona (CZE), Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), Cromatografia Líquida de Alta Eficiência por Exclusão Molecular (SEC-CLAE) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa (RP-CLAE). O objetivo do presente estudo foi padronizar e otimizar tais metodologias conforme recomendações da F.E. e do CIM, visando ao controle de qualidade do Insumo Farmacêutico Ativo (IFA) da EPOhr em Bio-Manguinhos. Além disso, através dessas técnicas avaliou-se uma amostra referente a um Lote Experimental contendo arginina (LEa) em comparação com a Preparação de Referência Biológica (BRP) da F.E. Assim como as demais proteínas glicosiladas, a EPOhr compreende uma mistura de isoformas relacionada ao grau de glicosilação e à presença de ácido siálico, o que foi evidenciado através das técnicas de IEF e CZE. Foram detectadas de 7 a 9 isoformas em IEF e 8 isoformas em CZE com os percentuais de cada uma de acordo com as especificações vigentes. O valor médio de PM da três amostras da EPOhr (IFA, LEa e BRP) estimado foi de 31,53 kDa através da SDSPAGE, onde detectou-se uma única banda eletroforética difusa de acordo com dados do CIM e da literatura. Além disso, os parâmetros para a validação das técnicas IEF e SDS-PAGE foram avaliados conforme a RE 899 da ANVISA e comprovam a sua reprodutibilidade. A SEC-CLAE e RP-CLAE demonstraram que a amostra analisada LEa não obteve percentual de pureza conforme as especificações da F.E. Entretanto, tais metodologias demonstraram-se eficazes e reprodutíveis para análise da pureza do produto intermediário da EPOhr, tendo em vista os perfis dos cromatogramas obtidos em concordância com as especificações e com baixa discrepância entre as réplicas. Conclui-se que após a completa validação das técnicas padronizadas no presente estudo, será possível a implantação na rotina do Controle de Qualidade em Bio-Manguinhos/Fiocruz uma adequada análise do IFA EPOhr quanto a sua homogeneidade.
Abstract: The Erythropoietin is a glycoprotein produced by the kidney that acts as a hormonal factor in the formation of erythrocytes. The cloning of the human erythropoietin gene led to the production of recombinant protein (EPOhr) for treatment of anemias associated with chronic renal therapeutic, use of zidovudine, cancer treatments and reduction of blood transfusion. The quality control of recombinant proteins requires the combination of methodologies for complete identification, characterization and evaluation of the biological potency. Among the methodologies advocated by the European Pharmacopoeia (E.P.) and the Center of Molecular Immunology (CIM) for the analysis of homogeneity of EPOhr stands the Isoelectric Focusing (IEF), Zone Capillary Electrophoresis (ZCE), Electrophoresis denaturing polyacrylamide gel (SDS-PAGE), High Performance Liquid Chromatography by Size Exclusion (SEC-HPLC) and High Performance Liquid Chromatography by Reversed Phase (RP-HPLC). The aim of this study was to standardize and optimize methodologies such as recommendations from F.E. and CIM in order to quality control of Active Pharmaceutical Ingredient (IFA) of EPOhr in Bio-Manguinhos. Furthermore, using these techniques a sample is evaluated referring to an experimental plot containing arginine (LEa) compared with the Biological Reference Preparation (BRP) of E.F. Like other glycosylated proteins, the EPOhr comprises a mixture of isoforms related to the degree of glycosylation and the presence of sialic acid, which was evidenced through the techniques of CZE and IEF. Were detected 7-9 isoforms in IEF and 8 isoforms in CZE with the percentages of each in accordance with the specifications in force. The average value of PM of the three samples (IFA, LEa and BRP EPOhr) was 31.53 kDa estimated by SDS-PAGE, which detected a single electrophoretic band diffuse according to the CIM and literature. Moreover, the parameters for the validation techniques IEF and SDSPAGE were evaluated according to RE 899 ANVISA and prove their reproducibility. The SEC-HPLC and RP-HPLC showed that the sample analyzed as LEa not obtained purity percentage as specified by E.F. However, these methods proved to be effective and reproducible for analysis the purity of intermediate product of EPOhr, because of the profiles of chromatograms obtained in accordance with the specifications and with low discrepancy between replicas. We conclude that after full validation of standardized techniques in this study, it will be possible to implement in routine Quality Control in Bio-Manguinhos/Fiocruz an adequate analysis of IFA EPOhr as homogeneity.
keywords: Controle de Qualidade
Eritropoetina
DeCS: Métodos de Análise
Issue Date: 2013
Citation: MEDEIROS, Ingrid Pinheiro de. Padronização e Otimização de Métodos Analíticos para o Controle de Qualidade da Eritropoetina Humana Recombinante. 2013. 138 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Imunobiológicos)-Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2013.
Date of defense: 2013
Place of defense: Rio de Janeiro
Department: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Imunobiológicos
Copyright: open access
Appears in Collections:Biomanguinhos - Dissertações de Mestrado

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