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Title: Desenvolvimento e caracterização de linhagem celular expressando estavelmente um replicon repórter do vírus Zika
Other Titles: Development and characterization of cell line stably expressing a Zika virus reporter replicon
Advisor: Gil, Laura Helena Vega Gonzales
Members of the board: Gil, Laura Helena Vega Gonzales
França, Rafael Freitas de Oliveira
Oliveira, Renato Antônio dos Santos
Authors: Silva, Caroline Simões da
Coadvisor: Silva Júnior, José Valter Joaquim
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Abstract: O vírus Zika (Zika virus, ZIKV) é um arbovírus membro da família Flaviviridae e gênero Flavivirus. Seu genoma é de RNA de sentido positivo e constituído por única matriz de leitura, responsável pela tradução das proteínas virais estruturais e não estruturais, ladeada por terminações não codificantes nas extremidades 5ˈ e 3ˈ. Atualmente, a ausência de vacinas ou fármacos anti-ZIKV licenciados e o número de casos reportados de infecções por ZIKV, além das complicações neurológicas decorrentes das infecções pelo vírus, colocam as infecções por ZIKV como um grande problema de saúde pública, sobretudo em regiões tropicais e subtropicais. Diante disso, o presente trabalho objetivou a construção de uma linhagem celular expressando estavelmente um subgenoma autoreplicativo (replicon) do ZIKV, expressando o gene repórter luciferase firefly (FLuc). Para tal, foi utilizado o genoma do ZIKV cepa ZIKVPE243/2015, previamente isolado em Pernambuco e clonado no vetor pSVJS01. A construção foi dividida estrategicamente em 3 fragmentos: i) o primeiro, abrigando a extremidade 5ˈUTR e a sequência do capsídeo do ZIKV; ii) o segundo, formado pelo gene repórter FLuc, uma região de ubiquitinação, gene da neomicina fosfotransferase e o IRES (Internal ribosome entry site) do vírus da encefalomiocardite; iii) o último fragmento, formado pelas proteínas não estruturais do ZIKV. Após a recombinação homóloga, a identidade do replicon, denominado de repZIKVPE243-LucNeoIres, foi confirmada através de PCR e sequenciamento. Transcritos in vitro produzidos a partir do cDNA clonado foram transfectados em células BHK-21 por eletroporação. Três dias após a transfecção, as células foram selecionadas em meio com geneticina (600µg/mL) e a linhagem celular recombinante obtida, BHK-21-rZIKV-LucNeoIres, foi avaliada quanto à expressão de FLuc. Durante 20 passagens, as células BHK-21-rZIKV-LucNeoIres apresentaram um aumento da atividade da FLuc de no mínimo 20 vezes em relação ao controle negativo. Por fim, a linhagem celular recombinante BHK-21-rZIKV-LucNeoIres poderá ser usada para o desenvolvimento de uma plataforma biotecnológica para triagem em larga escala de compostos anti-ZIKV e em estudos sobre a replicação viral.
Abstract: The Zika virus (Zika virus, ZIKV) is an arbovirus member of the family Flaviviridae and genus Flavivirus. Its genome is positive-sense RNA and consists of a single reading matrix, responsible for the translation of structural and non-structural viral proteins, flanked by noncoding endings at ends 5 and 3. Currently, the absence of licensed anti-ZIKV vaccines or drugs and the number of reported cases of ZIKV infections, in addition to the neurological complications resulting from the virus infections, place ZIKV infections as a major public health problem, especially in tropical regions and subtropical regions. Therefore, the present work aimed to construct a cell line stably expressing a ZIKV autoreplicative subgenome (replicon), expressing the reporter gene luciferase firefly (FLuc). For this, the genome of the ZIKV strain ZIKVPE243 / 2015, previously isolated in Pernambuco and cloned in vector pSVJS01, was used. The construct was strategically divided into 3 fragments: i) the first, harboring the 5’UTR end and the ZIKV capsid sequence; ii) the second, formed by the FLuc reporter gene, a ubiquitination region, neomycin phosphotransferase gene and the IRES (Internal ribosome entry site) of encephalomyocarditis virus; iii) the last fragment, formed by the non-structural proteins of ZIKV. After homologous recombination, the identity of replicon repZIKVPE243-LucNeoIres was confirmed by PCR and sequencing. In vitro transcripts produced from the cloned cDNA were transfected into BHK-21 cells by electroporation. Three days after transfection, the cells were selected in medium with geneticin (600μg / ml) and the recombinant cell line obtained, BHK-21-rZIKV-LucNeoIres, was evaluated for FLuc expression. During 20 passages, BHK-21-rZIKV-LucNeoIres cells showed an increase in FLuc activity of at least 20-fold compared to the negative control. Finally, the recombinant BHK-21-rZIKV-LucNeoIres cell line could be used in the development of a biotechnological platf
Keywords: Zika virus
Reverse genetics
Reporter replicon
keywords: Vírus Zika
Genética reversa
Replicon
DeCS: Zika vírus
Genética reversa
Replicon
Replicação Viral
Zika virus/genética
Zika virus/fisiologia
Células Cultivadas
Infecção pelo Zika virus/virologia
Recombinação Genética
Genoma Viral
DNA Complementar
Issue Date: 2019
Citation: SILVA, Caroline Simões. Desenvolvimento e Caracterização de Linhagem Celular Expressando Estavelmente um Replicon Repórter Do Vírus Zika. Dissertação. 2019. 69f. (Mestrado em Biociências e Biotecnologia em Saúde) – Instituto Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2019.
Date of defense: 2019-02-21
Place of defense: Recife/PE
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães.
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia em Saúde
Copyright: open access
Appears in Collections:PE - IAM - PPBBS - Dissertações de Mestrado

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